李 成，李佳琪，馬文哲，郝艷梅，趙桂治，張藝林，張 慶

腮腺腫瘤是口腔頜面部最常見(jiàn)的唾液腺腫瘤,其病理類型復(fù)雜，生物學(xué)行為多樣。由于發(fā)病機(jī)制尚未明了，對(duì)其生物學(xué)行為和腫瘤患者的預(yù)后亦缺乏理想的判斷指標(biāo)。沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)是一種具有高度的保守性，從古細(xì)菌到哺乳動(dòng)物都存在。既往研究，SIRT1對(duì)細(xì)胞的生存、凋亡、衰老等生理活動(dòng)起著十分重要的調(diào)節(jié)作用[1]；近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1表達(dá)水平與多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[2- 3]，但在腮腺腫瘤中的表達(dá)及相關(guān)意義尚無(wú)研究報(bào)道。本文旨在比較SIRT1在不同病理分級(jí)的腮腺腫瘤組織中的表達(dá)水平及意義,為腮腺腫瘤的分子靶向治療提供新的思路及依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：標(biāo)本來(lái)源于2017年7月-2019年12月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院行頜面外科術(shù)并經(jīng)病理切片證實(shí)為腮腺腫瘤的患者。術(shù)中取材均分成一式兩份：一份樣本送病檢，石蠟包埋，標(biāo)本制片，免疫組化檢測(cè)備用；一份樣立刻放入液氮，并置于-80 ℃凍存，用于Real-time PCR檢測(cè)。所有患者均為初治患者，取材前無(wú)其他頭頸部腫瘤史、無(wú)放化療及生物學(xué)治療史。

1.2 病例分組：病例樣本根據(jù)病理類型分為4組，即：A組為良性組19例，B組為交界性腫瘤組22例，C組為惡性腫瘤組18例，D組為癌旁組織組18例。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè):石蠟切片標(biāo)本經(jīng)二甲苯、乙醇梯度脫蠟至水、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷，抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行高溫抗原修復(fù)；冷卻后山羊血清封閉，SIRT1抗體(Abcam美國(guó)，1∶500)孵育過(guò)夜，二抗(HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG，碧云天生物公司，1∶1 000)室溫孵育1 h,DAB顯色，復(fù)染，封片，顯微鏡下觀察并記錄。免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性為棕黃色或褐色，在高倍鏡下觀察，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分之和進(jìn)行判斷：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比為0計(jì)0分，為陰性；1%～33%計(jì)1分，為弱陽(yáng)性；34%～66%計(jì)2分，為陽(yáng)性；67%～100%計(jì)3分高表達(dá)，為強(qiáng)陽(yáng)性。用PBS緩沖液替代一抗作為陰性對(duì)照片制備。

1.3.2 熒光定量PCR檢測(cè)：取出-80 ℃的凍存組織，錘擊破碎后加入Trizol試劑并進(jìn)行研磨后，進(jìn)行酚、仿抽提后沉淀，用無(wú)Rnase酶的水溶解總mRNA進(jìn)行定量，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,然后根據(jù)下述引物進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟簡(jiǎn)要如下：分別取2 mg瘤體組織、瘤旁組織擊碎后分別加入1 mL Triol (Thermo，美國(guó))，用組織勻漿機(jī)打碎混勻后，提取總RNA。取3 μg RNA并按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒MMLV(Invitrogen，美國(guó))進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,隨后進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增(sybgreen試劑盒，碧云天公司)。PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。引物序列：Sirt1,上游5′-TGGCAAAGGAGCAGATTAGTAGG-3′,下游 5′-CTGCCACAAGAACTAGAGGATAA-3′;GAPDH,上游5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′,下游5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT1在不同類型唾液腺腫瘤中的蛋白表達(dá)：SIRT1蛋白主要集中在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，在胞漿中也有少量表達(dá)，見(jiàn)圖1(封三)與表1。結(jié)果顯示，癌旁組織中SIRT1表達(dá)陽(yáng)性率16.7%，19例良性腫瘤組織中有6例SIRT1表達(dá)呈陽(yáng)性，陽(yáng)性表達(dá)率31.6%； 22例腮腺交界性腫瘤組織中，8例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率36.3%； 18例腮腺惡性腫瘤組織中，10例呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率55.6.%；與正常癌旁正常組織相比，腫瘤組織的SIRT1陽(yáng)性表達(dá)率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)，惡性腫瘤組織中 SIRT1 陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于良性腫瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 SIRT1在不同口腔腫瘤組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 SIRT1在不同類型唾液腺腫瘤中的mRNA表達(dá)水平：Real-Time PCR結(jié)果顯示(圖2，封三)，惡性腫瘤組的SIRT1表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)、高于良性腫瘤組(P<0.05)和交界性腫瘤(P<0.05)。交界性腫瘤組的SIRT1表達(dá)顯著高于癌旁組織(P<0.05)。

3 討論

眾所周知，腫瘤的發(fā)生與癌基因的過(guò)表達(dá)或者抑癌基因的低表達(dá)密切相關(guān)。SIRT1作為一種依賴于NAD+的組蛋白去乙?；?可參與眾多的生理及病理過(guò)程，包括調(diào)控細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、代謝、衰老和凋亡，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、分期分級(jí)及預(yù)后密切相關(guān)[4- 5]。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1在多種腫瘤組織中高表達(dá)，其中包括卵巢癌、胰腺癌[6]、肝癌[7]、肺癌[ 8]、胃癌以及淋巴瘤[9]等，而SIRT1在乳腺癌和結(jié)腸癌中表達(dá)情況說(shuō)法不一[10]。

本研究對(duì)59例臨床標(biāo)本利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了不同病理類型腮腺腫瘤中SIRT1 的表達(dá)，陽(yáng)性率依次為腺淋巴瘤32%、腮腺多形性腺瘤37%、腮腺鱗狀細(xì)胞癌58%。結(jié)果提示，SIRT1的表達(dá)水平在不同病理特征的腮腺腫瘤組織標(biāo)本中存在差異，病理分級(jí)惡性度越高， SIRT1的表達(dá)水平越高(P<0.05)。本研究同時(shí)檢測(cè)了上述不同病理類型腮腺腫瘤中SIRT1 mRNA的差異，結(jié)果表明腮腺鱗癌瘤組織SIRT1 mRNA水平明顯高于癌旁組織，高于交界性腫瘤組織及良性腫瘤。結(jié)果提示，SIRT1 mRNA水平與不同病理類型腮腺腫瘤的發(fā)生可能存在一定聯(lián)系。有研究報(bào)道細(xì)胞癌基因c-Myc可結(jié)合于SIRT1的啟動(dòng)子并誘導(dǎo)其表達(dá)，miRNA對(duì)SIRT1表達(dá)也具有調(diào)節(jié)作用[11-12],這些說(shuō)明SIRT1在調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的同時(shí)，也收到其它相關(guān)基因及調(diào)節(jié)因素的作用，在腮腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中SIRT1如何發(fā)揮作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究對(duì)SIRT1在不同病理分級(jí)腮腺腫瘤中表達(dá)及其臨床意義進(jìn)行了初步探討，結(jié)果提示SIRT1表達(dá)水平與惡性腮腺腫瘤轉(zhuǎn)移，尤其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是否有關(guān)系，后續(xù)將收集惡性多形性腺及腮腺鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例及增加樣本量進(jìn)一步分析，為開(kāi)展分子機(jī)制方面的研究及進(jìn)一步明確腮腺惡性腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移是否與SIRT1 表達(dá)上調(diào)有關(guān)，為惡性腮腺腫瘤的治療提供新的臨床途徑，并為尋求惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)提供可能的依據(jù)。