賈富霞 王秀娟 羅容

摘要 目的：研究酸橙枳實中黃酮類抗氧化藥效組分。方法：利用統(tǒng)計學中偏最小二乘法回歸方法，將酸橙枳實黃酮類組分HPLC共有峰峰面積和用清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、總抗氧化能力測定（FRAP）3個抗氧化活性指標結(jié)果進行回歸分析，得出參與抗氧化作用的藥效組分及各組分與抗氧化活性的相關(guān)性。用十批藥材各藥效組分的峰面積平均值計算藥效組分之間比例。結(jié)果：酸橙枳HPLC圖譜中的11個黃酮類組分峰與其抗氧化活性相關(guān)。與清除DPPH自由基正相關(guān)的藥效組分，相關(guān)性由大到小分別是：新橙皮苷>X1>野漆樹苷>柚皮苷>X6>X3，組分間比例為13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2;與清除ABTS自由基正相關(guān)的藥效組分，相關(guān)性由大到小分別是：新橙皮苷>野漆樹苷>X1，組分間比例為13.8∶1∶3.4;與總抗氧化能力正相關(guān)的藥效組分，相關(guān)性由大到小分別是：新橙皮苷>X1>柚皮苷>X3>川陳皮素>橙皮苷>X6>蕓香柚皮苷>X4>野漆樹苷>X2，組分間比例為13.8∶3.4∶14.9∶1.2∶1.9∶1.2∶1.5∶1.3∶0.8∶1∶0.4。結(jié)論：酸橙枳實抗氧化藥效效應(yīng)是多個黃酮類組分協(xié)同作用的結(jié)果;其中新橙皮苷、野漆樹苷和未知成分X1是酸橙枳實黃酮類抗氧化核心藥效組分;新橙皮苷、野漆樹苷和未知成分X1之間的比例為13.8∶1∶3.4。

關(guān)鍵詞 酸橙枳實;藥效組分;抗氧化;黃酮類;高效液相色譜法;自由基;總抗氧化能力;偏最小二乘回歸

Study on Antioxidative Active Components Alignment of Flavonoids from Aurantii Fructus Immaturus

JIA Fuxia， WANG Xiujuan， LUO Rong

（School of Traditional Chinese Medicine， Capital Medicinal University， Beijing 100069， China）

Abstract Objective：To study antioxidant active components alignment of flavonoids from aurantii fructus immaturus. Methods：By using the partial least squares regression method in statistics， the HPLC shared peak area of the flavonoids of citrus aurantium and the 3 antioxidant activities of scavenging DPPH free radicals， scavenging ABTS free radicals， and total antioxidant capacity（FRAP） were determined. Regression analysis was performed on the index results， and the pharmacodynamic components involved in the antioxidant effect and the correlation between each component and the antioxidant activity were obtained. The ratio between the effective components of the 10 batches of medicinal materials was calculated by using the average peak area of each effective component of the medicinal materials.Results：A total of 11 active components of flavonoids were relevant with antioxidant activity. The positive correlation of the pharmacodynamic components with DPPH radical scavenging was as follows：new hemperidin>X1>naringin>X6>X3， and the ratio was 13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2. For the active components positively correlated with ABTS free radical scavenging， the correlation from large to small was as follows：neohemperidin>wild sumacin>X1， with the ratio of 13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2. The positive correlation between the pharmacoactive components and total antioxidant capacity was as follows：neohiresperidin>X1>naringin>anacardin>naringin>X6>X3， the ratio of the components was 13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2; the effective components that were positively related to the scavenging of ABTS free radicals， the correlations from large to small were：neohesperidin>rhosperidin>X1， the ratio of the components was 13.8∶1∶3.4; the effective components that were positively related to the total antioxidant capacity， the correlations from large to small were：neohesperidin>X1>naringin>X3>Chrysanthin>Hesperidin>X6>Rutinnaringin>X4>Rhosoprin>X2， the ratio of the components was 13.8∶3.4∶14.9∶1.2∶1.9∶1.2∶1.5∶1.3∶0.8∶1∶0.4. Conclusion：The antioxidant active of Aurantii Fructus Immaturus is the results of synergisticeffect from many kinds of Flavonoids. Among them， neohesperidin， anacardin and unknown component X1 are the core anti-oxidant components of Lime Citrus aurantium flavonoids; the ratio of neohesperidin， anacardin and unknown ingredient X1 is 13.8∶1∶3.4.

Keywords Aurantii Fructus Immaturus; Active components alignment; Antioxidant; Flavonoids; High performance liquid chromatography; Free radical; Total antioxidant capacity; Partial least squares regression

中圖分類號：R284文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.009

現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，器官正常活動或氧化壓力過剩產(chǎn)生的活性氧等自由基，在體內(nèi)超出一定量后會導致或間接導致多種疾病的發(fā)生，如衰老、腫瘤、炎癥、動脈粥樣硬化、高血壓、免疫性疾病等[1-8]，因此對天然的具有抗氧化能力的藥物研究的越來越多。

枳實為常用中藥，傳統(tǒng)來源為蕓香科植物酸橙（Citrus aurantium L.）的干燥幼果，通稱“酸橙枳實”。功效破氣消積、化痰散痞，用于積滯內(nèi)停，痞滿脹痛，瀉痢后重，大便不通，痰滯氣阻，胸痹，結(jié)胸，臟器下垂，是中醫(yī)臨床上常用的理氣藥之一[9]。枳實主要含有生物堿，黃酮和揮發(fā)油3大類成分?，F(xiàn)代藥理研究已表明黃酮類成分有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗菌、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等作用[10-17]，并且課題組前期研究已證實枳實的抗氧化效應(yīng)明確[18]，但枳實中哪些組分參與了抗氧化作用，目前實驗研究還是很少涉及。

我們利用統(tǒng)計學中偏最小二乘法回歸方法，將酸橙枳實HPLC組分圖譜的共有峰峰面積和用清除DPPH自由基、清除ABTS自由基、總抗氧化能力測定（FRAP）3個抗氧化活性指標結(jié)果進行回歸分析，篩選出枳實藥材中發(fā)揮抗氧化活性的黃酮類藥效組分，以期為枳實的藥效組分研究和質(zhì)量評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

多功能讀板儀（美谷分子儀器上海有限公司，型號：Versa max）;電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司，十萬分之一，型號：Sartorious）;超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，型號：KQ-520DE）;96孔板（康寧公司，型號：costar3599）。

1.2 試劑

乙腈（Fisher公司，美國，貨號：A988-4）;娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司，批號：20141123）;過硫酸鉀（上海國藥集團化學試劑有限公司，批號：10017418）;乙酸（北京化工廠，批號：20150911）;甲醇（北京化工廠，批號：20140116）;無水乙醇;（北京化工廠，批號：20140713）DPPH（Sigma公司，美國，貨號：1898-66-4）;ABTS（Sigma公司，美國，貨號：A1888-5g）;總抗氧化能力監(jiān)測試劑盒（FRAP法）（碧云天生物技，貨號：S0116）。

1.3 分析樣品

經(jīng)首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院羅容副教授鑒定為酸橙枳實（Citrus aurantium L.）的干燥幼果。見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 枳實的HPLC黃酮類組分圖譜測定

2.1.1 樣品溶液制備

精密稱取枳實藥材樣品0.5 g（過65目篩），精密稱定，置圓底燒瓶中，加水10 mL，100 ℃水浴提取1 h，過濾，殘渣再加水10 mL，提取1 h，過濾，將兩次濾液合并至蒸發(fā)皿中，濃縮至約10 mL，再轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，水定容至25 mL，作為樣品溶液。

2.1.2 HPLC色譜條件

色譜柱：Agilent Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-水（B，含0.2%乙酸）;檢測波長：330 nm;柱溫30 ℃;流速1.0 mL/min;進樣量10 μL;自動進樣。流動相梯度洗脫情況見表2。

2.1.3 酸橙枳實HPLC黃酮類組分圖譜的研究

精密稱取10批枳實藥材粉末各0.5 g，分別按照2.1.1項下方法制備樣品溶液，依據(jù)2.1.2項下HPLC色譜條件，進樣10 μL，記錄色譜圖。將各批次枳實藥材的HPLC黃酮類組分圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版，設(shè)定匹配（中位數(shù)）模板，生成對照組分圖譜。其中12個色譜峰為10批樣品的共有峰，確定為組分峰（圖1）。通過已有對照品確定峰1為蕓香柚皮苷、峰2為柚皮苷、峰3為野漆樹苷、峰4為橙皮苷，峰5為新橙皮苷、峰10為川陳皮素。X表示未指認藥效組分。10批樣品的共有組分峰的各自平均峰面積見表3、表4。

2.2 枳實體外抗氧化活性實驗

2.2.1 枳實對DPPH自由基清除率的測定

2.2.1.1 DPPH溶液的配制

精密稱定DPPH適量，加甲醇溶解，制成濃度約為0.16 mmol/L的DPPH溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.1.2 DPPH標準曲線制作

將2.2.1.1項下的母液分別用甲醇配制成濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的DPPH溶液，加入到96孔板中，每個濃度7個復孔，以甲醇溶液為空白對照，在波長517 nm處測定吸光度。經(jīng)測定，DPPH標準曲線方程y=5.897 4x-0.008 6（r=0.999 0）。見圖2，表明DPPH溶液為0.01～1.0 mmol/L和吸光度之間線性關(guān)系良好。

2.2.1.3 DPPH清除率的測定

精密吸取質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的各樣品溶液0.1 mL加樣在96孔板中，再在每個孔中分別加入DPPH溶液0.1 mL，搖勻，避光放置反應(yīng)30 min，于波長517 nm處測定吸光度值。以0.1 mL水溶液和0.1 mLDPPH溶液為對照，以0.1 mL水溶液和0.1 mL甲醇溶液為空白參比。計算各濃度的DPPH清除率。見表5。

清除率（%）=[1-（As-Ao）/Ac]×100%

As—藥材溶液加DPPH溶液的吸光度值;Ao—溶劑加DPPH溶液的吸光度值;Ac—溶劑加藥材溶液的吸光度值。

2.2.2 枳實對ABTS自由基清除率的測定

2.2.2.1 ABTS工作液的配制

將ABTS水溶液（7.4 mmol/L）和過硫酸鉀水溶液（2.5 mmol/L），等量混合避光反應(yīng)12 h，得到ABTS工作液。使用時用無水乙醇稀釋至該溶液在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。ABTS工作液應(yīng)在24 h之內(nèi)用完。

2.2.2.2 ABTS清除率的測定

精密吸取質(zhì)量濃度為0.037 mg/mL的各樣品溶液0.1 mL分別加入ABTS工作液0.1 mL，搖勻，避光放置反應(yīng)5 min，于波長734 nm處測定吸光度值。以0.1 mL水溶液和0.1 mLABTS工作液為對照，以0.1 mL水溶液和0.1 mL無水乙醇溶液為空白參比。計算各濃度的清除率。見表5。

清除率（%）=[1-（As-Ao）/Ac]×100%

As—藥材溶液加ABTS工作液的吸光度值;Ao—溶劑加ABTS工作液的吸光度值;Ac—溶劑加藥材溶液的吸光度值。

2.2.3 FRAP法測定枳實藥材總抗氧化能力

2.2.3.1 FeSO4標準曲線的繪制

稱取27.8 mg試劑盒中提供的FeSO4·7H2O，用蒸餾水溶解并定容到1 mL，此時濃度即為100 mmol/L。取適量100 mmol/LFeSO4溶液分別稀釋至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5 mmol/L。在波長593 nm下測定各濃度的吸光度，以FeSO4濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（見圖3）。得到FeSO4溶液的標準曲線方程為：y=0.297 4x+0.000 8（r=0.999 9），表明FeSO4溶液在0.15～1.5 mmol/L與吸光度之間線性關(guān)系良好。

2.2.3.2 總抗氧化能力測定

根據(jù)待測樣品的數(shù)量，按照試劑盒的說明，配制適量的FRAP工作液（FRAP工作液配制后37 ℃孵育，并在1～2 h內(nèi)使用完畢）。再按試劑盒方法，進行樣品的吸光度測定。依據(jù)FeSO4溶液的標準曲線進行計算，結(jié)果以樣品的mmol Fe2+/g干重來表示。值越大，表明有抗氧化物質(zhì)還原的越多，即抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性越強。見表5。

2.3 分析方法

根據(jù)10批酸橙枳實藥材的HPLC黃酮類組分圖譜，將已確定的12個共有峰的峰面積和抗氧化活性藥效指標利用R語言中的偏最小二乘回歸方法進行分析。與功效的相關(guān)系數(shù)越大表示此組分對此功效貢獻越大。相關(guān)系數(shù)正值表示正相關(guān)，負值表示負相關(guān)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)柚皮苷、X1、野漆樹苷、新橙皮苷、X3、X6、橙皮苷、X4、蕓香柚皮苷等成分與DPPH清除率呈正相關(guān);野漆樹苷、柚皮苷、X3、橙皮苷、X1、X6組分與ABTS清除率呈正相關(guān);新橙皮苷、柚皮苷、X1、蕓香柚皮苷、X3、川陳皮素、橙皮苷、X6、野漆樹苷、X4、X2組分與總抗氧化能力呈正相關(guān)。見表6。

2.4 實驗結(jié)果

酸橙枳實HPLC圖譜中的11個黃酮類組分峰與其抗氧化活性相關(guān)。其中與清除DPPH自由基呈正相關(guān)的藥效組分，相關(guān)性由大到小分別是：新橙皮苷>X1>野漆樹苷>柚皮苷>X6>X3，組分間比例為13.8∶3.4∶1∶14.9∶1.5∶1.2;與清除ABTS自由基呈正相關(guān)的藥效組分，相關(guān)性由大到小分別是：新橙皮苷>野漆樹苷>X1，組分間比例為13.8∶1∶3.4;與總抗氧化能力呈正相關(guān)的藥效組分，相關(guān)性由大到小分別是：新橙皮苷>X1>柚皮苷>X3>川陳皮素>橙皮苷>X6>蕓香柚皮苷>X4>野漆樹苷>X2，組分間比例為13.8∶3.4∶14.9∶1.2∶1.9∶1.2∶1.5∶1.3∶0.8∶1∶0.4。酸橙枳實抗氧化藥效效應(yīng)是多個黃酮類組分協(xié)同作用的結(jié)果;其中新橙皮苷、野漆樹苷和未知成分X1與3個功效抗氧化功效指標均呈正相關(guān)性，是酸橙枳實黃酮類抗氧化作用的核心藥效組分;新橙皮苷、野漆樹苷和未知成分X1之間的比例為13.8∶1∶3.4。

3 討論

本實驗中用了3個抗氧化指標表征對枳實抗氧化活性。發(fā)現(xiàn)對每個指標有貢獻的藥效組分不一致，可能是因為此3個抗氧化指標測定方法的機制不同。ABTS法和DPPH法都是檢測樣品對自由基的清除能力，DPPH法是利用抗氧化劑清除DPPH自由基時，與其孤對電子配對而使其在波長517 nm處的吸光值降低，溶液顏色變淺的原理[19]。ABTS法則是當ABTS在適當?shù)难趸瘎┳饔孟卵趸删G色的ABTS·+，在抗氧化物存在時ABTS·+的產(chǎn)生會被抑制，在波長734 nm處測定ABTS的吸光度即可測定并計算出樣品抗氧化能力。而（FRAP法）總抗氧化能力測定則是基于氧化還原反應(yīng)的比色法，在酸性條件下三價鐵被抗氧化劑還原成二價鐵在波長593 nm處有強吸收，從而檢測抗氧化劑的還原能力[20]。也可能是中藥中的天然抗氧化劑的協(xié)同作用所致。但通過實驗結(jié)果也可以看出，與3種抗氧化方法測定出的同時對枳實抗氧化活性有貢獻且呈正相關(guān)的藥效組分為新橙皮苷、野漆樹苷和未知成分X1，可認為此3個藥效組分是枳實抗氧化活性的主要藥效組分。

抗氧化活性主要是表現(xiàn)在抑制脂質(zhì)氧化降解、清除自由基、抑制促氧化劑和還原能力等方面。由于抗氧化反應(yīng)的多樣性和復雜性，體外評價方法的機制不同，同一種物質(zhì)在不同評價體系里可能會表現(xiàn)出不同的抗氧化活性，故現(xiàn)在還沒有一種方法能綜合評價某一物質(zhì)的抗氧化能力。本實驗綜合各種抗氧化方法，以快速、簡便、靈敏，不需要復雜儀器為原則，選擇了清除DPPH自由基、ABTS自由基和總抗氧化能力檢測（FRAP法）3種方法來測定枳實的抗氧化活性。

從本實驗中得到參與抗氧化作用的黃酮類藥效組分，只指認了蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、野漆樹苷、柚皮苷和橙皮苷等6個組分，X1、X2、X3、X4和X6還未被指認，需要再進一步深入研究。

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（2019-04-22收稿 責任編輯：楊覺雄）

基金項目：國家自然科學基金項目（81303175）;國家自然科學基金面上項目（81973431）;北京市中醫(yī)藥科技發(fā)展資金規(guī)劃項目（JJ2018-41）

作者簡介：賈富霞（1974.02—），女，碩士，副主任技師，研究方向：中藥質(zhì)量控制，E-mail：jfxia74@163.com

通信作者：羅容（1978.11—），女，博士，副教授，碩士研究生導師，研究方向：中藥鑒定方法學和中藥質(zhì)量評價，E-mail：zhongyaojianding@126.com