孫艷華 李明 徐建立 董路 曹學彬 孟小晶

摘要 目的：研究紫草素通過激活活性氧（ROS）自由基誘導大腸癌細胞凋亡的作用機制。方法：通過MTT測定法檢測紫草素對人結腸癌細胞系HCT116和SW480細胞活力的影響，結合Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒及流式細胞術檢測細胞凋亡情況;通過Caspase 3/9活性測定試劑盒檢測半胱天冬酶活性，使用ROS檢測試劑盒檢測紫草素處理對HCT116和SW480細胞中ROS水平的影響，并借助Western Blotting檢測Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達情況。結果：細胞活力檢測結果顯示，人正常結腸黏膜上皮細胞系NCM460對紫草素干預不敏感，而紫草素對人結腸癌細胞系HCT116和SW480細胞活力表現(xiàn)出顯著的抑制作用（均P<0.05）。在紫草素干預后，Western Blotting分析檢測到細胞周期蛋白D、c-Myc、Bcl-2和Bcl-xL蛋白表達水平顯著下調(diào)（均P<0.05）。同時，紫草素以劑量依賴性方式上調(diào)了Caspase3和Caspase9蛋白表達水平（均P<0.05）。流式細胞術檢測結果表明，經(jīng)10 μmol/L紫草素處理24 h后，HCT116和SW480細胞凋亡率增加至59.2%和65.6%，而幾乎沒有壞死細胞（Annexin V-，PI+）;并檢測到HCT116和SW480細胞線粒體膜電位被去極化。ROS水平檢測結果顯示，紫草素以劑量依賴性方式上調(diào)了HCT116和SW480細胞ROS水平。結論：紫草素通過線粒體介導途徑誘導結腸癌細胞凋亡，Bcl-2蛋白家族和細胞內(nèi)ROS水平升高在該過程中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞 紫草素;結腸癌;活性氧;細胞凋亡;細胞增殖;細胞活力;Bcl-2家族蛋白;線粒體

Shikonin by Activating Reactive Oxygen Species ROS to Inducing Apoptosis in Colorectal Cancer Cells

SUN Yanhua，LI Ming，XU Jianli，DONG Lu，CAO Xuebin，MENG Xiaojing

（Cangzhou People′s Hospital，Cangzhou 061000，China）

Abstract Objective：To study the molecular mechanism of shikonin by activating reactive oxygen species ROS to induce apoptosis of colorectal cancer cells.Methods：The effect of shikonin on the viability of human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 was detected by MTT assay，combined with Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and flow cytometry to detect cell apoptosis; by Caspase 3/9 activity assay kit and caspase activity were was detected.ROS detection kit was used to detect the effect of shikonin treatment on the ROS levels in HCT116 and SW480 cells，and the expression of Bcl-2 and Bcl-xL proteins was detected by Western Blotting.Results：Cell viability test results showed that human normal colonic mucosal epithelial cell line NCM460 was not sensitive to shikonin intervention，while shikonin showed a significant inhibitory effect on human colon cancer cell lines HCT116 and SW480 cells（P<0.05）.Western Blotting detected cyclin D and c-Myc，and Bcl-2 and Bcl-xL protein levels were significantly down-regulated after shikonin intervention（P<0.05）.Meanwhile，shikonin increased the expression levels of Caspase3 and Caspase9 protein in a dose-dependent manner（P<0.05）.Flow cytometry results showed that after treated with 10 μmol/L shikonin for 24 h，the apoptosis rate of HCT116 and SW480 cells increased to 59.2% and 65.6%，with almost no necrotic cells（Annexin V-，PI+）; Mitochondrial membrane potentials to HCT116 and SW480 cells were depolarized.ROS levels showed that shikonin up-regulated ROS levels in HCT116 and SW480 cells in a dose-dependent manner.Conclusion：Shikonin induces apoptosis of colon cancer cells through mitochondria-mediated pathway，and Bcl-2 protein family and intracellular ROS levels play an important role in this process.

Keywords Shikonin; Colon cancer; Reactive oxygen species; Cell apoptosis; Cell Proliferation; Cell viability; Bcl-2 family protein; Mitochondria

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.018

結腸癌是目前世界范圍內(nèi)高發(fā)性癌癥之一，其中發(fā)達國家發(fā)病率較高，主要歸因于不健康的飲食以及肥胖[1]。隨著社會高速發(fā)展，結腸癌確診病例在我國呈現(xiàn)高速增長趨勢[2]。已有研究報道，紫草素可有效抑制乳腺癌、肝癌和肺癌等腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡和自噬[3-6]。但是紫草素誘導自噬的作用機制尚未闡明。細胞凋亡和壞死性凋亡是限制惡性細胞成活和傳播的天然過程[7]。活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）作為腫瘤生物學的重要研究指標，一方面，氧化應激直接參與了腫瘤生長，轉移;另一方面，細胞內(nèi)ROS的累積會對細胞器的蛋白質、酶和質膜系統(tǒng)造成損害，最終激活細胞凋亡信號通路[8-10]。因此，增加氧化應激是選擇性殺死癌細胞的重要治療策略。本研究旨在闡明外源性氧化應激介導的細胞凋亡在紫草素誘導大腸癌HCT116和SW480細胞凋亡的作用機制，以期將紫草素開發(fā)為結腸癌治療藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人結腸癌細胞系HCT116和SW480，以及正常人結腸黏膜上皮細胞系NCM460，由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所提供，本研究已獲醫(yī)院倫理委員會批準（倫理審批號：CZRMYY-JCSY-1903-N018）。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)于CO2濃度為5%，溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中。

1.1.2 藥物 紫草素（Sigma-Aldrich公司，美國，貨號：hc10871），溶解于二甲基亞砜（DMSO）中使用。

1.1.3 試劑與儀器 RPMI 1640常規(guī)培養(yǎng)基（ThermoFisher公司，美國，貨號：A4192302）。ZVAD-FMK（MedChemExpress公司，美國，貨號：161401-82-7），碘化丙啶緩沖液（江蘇碧云天生物技術研究所，貨號：ST512），N-乙酰基-L-半胱氨酸（NAC）（江蘇碧云天生物技術研究所，貨號：S0077），L-谷胱甘肽（GSH）（江蘇碧云天生物技術研究所，貨號：S0077）。Caspase 3/9活性測定試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，貨號：C1115/C1158），ROS檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，貨號：S0033M），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（江蘇碧云天生物技術研究所，貨號：C1075M），Pierce BCA蛋白質測定試劑盒（Thermo Scientific公司，美國，貨號：23225）?？贵wBcl-2（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：15071），抗體Bcl-xL（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：2764），抗體BAX（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：89477），抗體Caspase 3（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：9662），抗體Caspase 9（Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：9508），抗體β-actin（Abcam公司，英國，貨號：ab8226），抗體c-Myc（Abcam公司，英國，貨號：ab32072），抗體Cyclin D（Abcam公司，英國，貨號：ab141070），抗體Cyclin E（Abcam公司，英國，貨號：ab33911），辣過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗小鼠二抗（Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-47778），山羊抗兔二抗（Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-2357）。FACS流式細胞儀（BD Biosciences公司，加拿大，貨號：343020）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific公司，美國，型號：51030993），酶標儀（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美國，型號：168-1130），電泳系統(tǒng)（Bio-Rad Laboratories，Inc.，美國，型號：BJ005269）。

1.2 方法

1.2.1 細胞活力測定 根據(jù)實驗操作方案使用MTT測定法檢測細胞活力。具體操作步驟為：將細胞接種在96孔細胞培養(yǎng)板中，并用不同濃度的藥物處理特定時間。處理好的細胞用MTT（5 mg/mL）溫育4 h，并在除去上清液后用DMSO溶解。最后，在酶標儀中490 nm處測量吸光度。實驗分組包括：1）不同濃度梯度紫草素處理對SW480、HCT116和SW480細胞成活率影響實驗，紫草素濃度設置0、2.5、5、7.5、10、12.5、15 μmol/L;2）5 μmol/L紫草素處理3組細胞不同時間梯度對細胞成活率影響實驗，檢測時間設置0、6、12、18、24、30、36 h。

1.2.2 細胞周期檢測 將SW480細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)板中12 h，然后用不同濃度紫草素處理24 h。使用FACS流式細胞儀在具有RNase的碘化丙啶緩沖液存在的情況下進行細胞周期檢測。

1.2.3 細胞凋亡分析 將HCT116和SW480細胞接種在6孔細胞培養(yǎng)板板中12 h，然后用對應試劑處理24 h，收獲細胞并用預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次。通過Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒及FACS流式細胞儀進行細胞凋亡檢測。實驗分組：紫草素濃度設置：0、2.5、5、10 μmol/L。

1.2.4 Caspase 3及Caspase 9活性檢測 根據(jù)操作說明使用Caspase 3/9活性測定試劑盒檢測半胱天冬酶活性。具體操作步驟為：將細胞置于6孔細胞培養(yǎng)板中12 h，用試劑處理24 h，收獲并重懸于裂解緩沖液中。將細胞蛋白質標準化，并通過底物和酶之間的相互作用評估半胱天冬酶活性。

1.2.5 Western Blotting檢測 將細胞或腫瘤組織懸浮于Laemmli緩沖液中。蛋白質濃度使用BCA蛋白質測定試劑盒進行測定。等量蛋白質樣品通過SDS-PAGE進行電泳，并轉移到聚偏二氟乙烯轉移膜。用TBST中的5%新鮮脫脂牛奶封閉膜，并在4 ℃下與TBST中的特異性一抗孵育過夜。將膜用TBST洗滌3次，并在室溫下與第二抗體溫育2 h。最后，使用ECL試劑盒進行曝光顯影，用凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質條帶圖片。實驗分組包括：1）不同濃度紫草素處理對Cyclin D，Cyclin E和c-Myc蛋白表達水平的影響，紫草素濃度設置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）不同濃度紫草素處理對Caspase3和Caspase9蛋白表達水平的影響，紫草素濃度設置：0、10、20、30 μmol/L;3）不同濃度紫草素處理對Bcl-2、Bcl-xL和BAX蛋白表達水平的影響，紫草素濃度設置：0、10、20、30 μmol/L。

1.2.6 細胞內(nèi)ROS檢測 使用ROS檢測試劑盒測量細胞內(nèi)ROS。具體操作步驟為：將細胞置于6孔細胞培養(yǎng)板中12 h，用試劑處理12 h，并在37 ℃及黑暗中與DCFH-DA探針溫育。通過流式細胞儀測量DCF熒光強度。實驗分組：1）不同濃度梯度紫草素處理對ROS水平的影響，紫草素濃度設置：0、2.5、5、10 μmol/L;2）抗氧化劑NAC或GSH干預再接受紫草素處理對ROS水平、凋亡率、Caspase 3和Caspase 9活性的影響，其中DMSO組只經(jīng)DMSO處理;SHK組只接受紫草素處理;SHK+NAC組經(jīng)NAC干預，并接受紫草素處理;SHK+GSH組經(jīng)GSH干預，并接受紫草素處理。

1.2.7 細胞轉染 為闡明Bcl-2家族蛋白在紫草素誘導細胞凋亡中的作用機制，首先，在GV316質粒中構建Bcl-2和Bcl-xL過表達質粒。Bcl-2和Bcl-xL表達質粒由Genechem Institute（中國上海）合成。使用Thermo Fisher Scientific的Lipofectamine TM 2000進行質粒轉染。其次，通過Western Blotting檢測過表達載體瞬時轉染SW480細胞中的過表達情況;其中，Control組轉染GV316質粒;GV316-Bcl-2組轉染GV316 Bcl-2過表達質粒;GV316-Bcl-xL組轉染GV316 Bcl-xL過表達質粒。按1.2.3所述實驗方法，對Bcl-2和Bcl-xL過表達SW480細胞再接受紫草素處理的凋亡率進行檢測分析;其中，Control組轉染GV316質粒，不經(jīng)紫草素處理;SHK組轉染GV316質粒，并接受紫草素處理;SHK+Bcl-2組轉染GV316 Bcl-2過表達質粒，并接受紫草素處理;SHK+Bcl-xL組轉染GV316 Bcl-xL過表達質粒，并接受紫草素處理。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism ver.6統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 紫草素對結腸癌細胞增殖的抑制作用 結果表明，紫草素以劑量依賴性方式抑制結腸癌細胞增殖，同時，紫草素對人結腸癌細胞系HCT116和SW480的抑制活性顯著高于人正常結腸黏膜上皮細胞系NCM460（P<0.05）。這表明，紫草素對殺死腫瘤細胞呈現(xiàn)出一定選擇性。同時本研究也確定了紫草素處理的時間依賴效應。結果表明，紫草素對人結腸癌細胞系HCT116，SW480的抑制效果隨時間依賴性增加，并且人正常結腸黏膜上皮細胞系NCM460對培養(yǎng)時間的增加仍然不敏感，更接近其隨時間延長的自然生長狀態(tài)。Western Blotting分析檢測到參與G1期的細胞周期蛋白D和c-Myc受紫草素處理影響，其蛋白表達明顯減少。見圖1。

2.2 紫草素誘導結腸癌細胞凋亡 流式細胞術統(tǒng)計分析結果表明，經(jīng)濃度梯度紫草素處理后，HCT116和SW480誘導細胞凋亡率明顯增加，而幾乎沒有壞死細胞（Annexin V-，PI+）。同時，HCT116和SW480細胞經(jīng)ZVAD干預后，也沒有觀察到壞死比例增加的現(xiàn)象。此外，早期凋亡細胞（Annexin V+，PI-）的比例隨著ZVAD的共同處理而降低，表明紫草素具有誘導細胞凋亡的能力。Caspase3和Caspase9的Western Blotting檢測到紫草素誘導的細胞凋亡中半胱天冬酶裂解的劑量呈依賴性作用。這些結果表明，紫草素激活了Caspase級聯(lián)反應，進而誘導結腸癌細胞凋亡。見圖2。

2.3 由線粒體介導紫草素誘導的細胞凋亡作用?? 流式細胞術檢測結果表明，HCT116和SW480細胞在紫草素濃度梯度處理后，其線粒體膜電位被去極化。Western Blotting檢測結果顯示，Bcl-2和Bcl-xL的表達隨著紫草素的處理呈現(xiàn)下降趨勢，但沒有發(fā)現(xiàn)其中BAX的顯著變化。為了進一步闡明Bcl-2家族在紫草素誘導的細胞凋亡作用機制，瞬時轉染構建了Bcl-2和Bcl-xL的過表達體系，再經(jīng)紫草素處理，Bcl-2或Bcl-xL過表達觀察組的細胞凋亡率降低。這些數(shù)據(jù)表明紫草素通過激活結腸癌細胞中的線粒體介導途徑來誘導細胞凋亡。見圖3。

2.4 ROS水平在紫草素誘導細胞凋亡中的作用?? ROS水平檢測結果表明，紫草素劑量依賴性地促進結腸癌細胞中ROS的產(chǎn)生。NAC和GSH是2種常規(guī)抗氧化劑，通過與紫草素共同處理發(fā)現(xiàn)，NAC或GSH可以阻斷紫草素依賴性細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，同時，使得細胞凋亡率顯著降低。此外，結腸癌細胞Caspase 3和Caspase 9活性在抗氧化劑NAC或GSH作用下明顯降低，而紫草素誘導的線粒體膜電位去極化效果也因NAC或GSH作用而減弱。以上結果表明，紫草通過提高細胞內(nèi)ROS水平和活化線粒體介導的凋亡通路來實現(xiàn)結腸癌細胞凋亡。見圖4。

3 討論

癌癥是全球性公共衛(wèi)生問題，盡管在癌癥早期診斷和治療方面已經(jīng)進行了大量研究，但許多患者仍死于化療藥物耐藥性引起的疾病復發(fā)[11]。因此，新藥研發(fā)能為結腸癌治療提供了更多可選方案。紫草素已被證實具有抗腫瘤治療效果[12-13]。本研究實驗結果表明，紫草素以劑量依賴的方式有效抑制結腸癌細胞增殖，其中的細胞周期蛋白是紫草素抗癌作用的靶點之一，這與紫草素在乳腺癌細胞相關研究報道結果類似[14]。已有的紫草素安全性相關研究報道中，也證實紫草素對非腫瘤細胞的毒性極小，例如胃上皮細胞系GES-1[15]和正常人肝細胞系L02[5]。綜合本研究結果，紫草素是具備進一步發(fā)展臨床應用價值的結腸癌治療藥物。

腫瘤藥物抗性的潛在機制主要歸因于抗細胞凋亡途徑，癌細胞對化學治療藥物誘導細胞凋亡的敏感性取決于促凋亡信號和抗細胞凋亡信號之間的平衡。死亡受體介導途徑和線粒體介導途徑是2種主要的凋亡途徑[16]。紫草素已被證實為許多腫瘤中的細胞凋亡誘導劑[15]。細胞凋亡是經(jīng)遺傳編碼的程序性細胞死亡，這對于機體在生理和病理條件下發(fā)揮著至關重要的作用[17-18]。已有研究報道中，紫草素通過誘導程序性細胞死亡，包括凋亡和壞死實現(xiàn)其抗腫瘤效果[19]。本研究結果表明，紫草素以劑量依賴的方式誘導結腸癌細胞HCT116和SW480細胞系凋亡，而并沒有發(fā)現(xiàn)明顯的壞死細胞（Annexin V-，PI+）。此外，泛半胱天冬蛋白酶抑制劑ZVAD在本研究中顯示出有效降低早期凋亡細胞比例的作用，進一步證實紫草素誘導細胞凋亡而非細胞壞死性凋亡。

線粒體介導凋亡途徑作為主要的凋亡途徑之一，Bcl-2家族蛋白在其中發(fā)揮著重要作用[20-21]。本研究對HCT116和SW480細胞的線粒體膜電位的檢測表明，在紫草素處理后線粒體膜電位去極化，并且通過Bcl-2或Bcl-xL的過表達可抵消部分去極化作用。盡管作為線粒體凋亡蛋白的具體作用機制需要進一步研究，但Bcl-2家族成員在調(diào)節(jié)紫草素誘導的結腸癌細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。而進一步對半胱天冬蛋白酶的檢測結果表明，紫草素增加了Caspase3和Caspase9的活性。以上結果證實，紫草素在結腸癌細胞中誘導Bcl-2家族的線粒體凋亡程序。

與正常細胞比較，腫瘤細胞具有更高的代謝和氧化應激，更容易受外源因子誘導的ROS水平變化影響[22]。因此，提高腫瘤細胞內(nèi)ROS水平有望作為一種選擇性殺死癌細胞的策略。細胞內(nèi)ROS的積累包括2種來源，其一是異常代謝產(chǎn)生，另外還可以通過外源性藥物誘導產(chǎn)生。ROS積累可以激活線粒體依賴性凋亡[23-24]，紫草素誘導某些腫瘤細胞中ROS的累積已有研究報道[25]?；诩毎麅?nèi)ROS將不發(fā)熒光的DCFH探針氧化成可以通過流式細胞儀檢測的DCF熒光探針，便于檢測紫草素處理對HCT116和SW480細胞中ROS水平的影響。目前的一些化療藥物通過直接產(chǎn)生ROS，或通過破壞抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用[26]。本研究結果表明，紫草素以劑量依賴性地提高結腸癌細胞內(nèi)ROS水平。為了闡明紫草素誘導的細胞凋亡中ROS水平變化機制，進一步評估了2種抗氧化劑，NAC和GSH抗氧化劑有效改善了紫草素誘導的細胞死亡和半胱天冬蛋白酶活化。此外，NAC和GSH抵消了紫草素誘導的線粒體膜電位去極化和Bcl-2或Bcl-xL表達降低。這表明在紫草素誘導的結腸癌細胞凋亡中，ROS作用于線粒體介導通路上游。以上實驗結果證明，ROS的積累，下調(diào)了Bcl-2和Bcl-xL的表達，線粒體膜電位的去極化，以及半胱天冬蛋白酶級聯(lián)反應的激活保證了紫草素誘導的結腸癌細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明紫草素具有誘導結腸癌細胞凋亡的能力。紫草素誘導的結腸癌細胞凋亡由線粒體介導，并受Bcl-2蛋白家族調(diào)節(jié);細胞內(nèi)ROS水平提高在紫草素誘導的細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。結合已有紫草素安全性相關研究結果，紫草素可以作為人類結腸癌的潛在治療候選藥物。

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（2020-05-20收稿 責任編輯：楊燕）

基金項目：河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃項目（20191249）

作者簡介：孫艷華（1981.05—），男，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：腸胃疾病的發(fā)病機制和臨床診治，E-mail：DrMaJcang@126.com