陳東漢，曾玉英，陳 帥，趙 燦，黃 璐，鄭小剛，李明莉，張志明，尤 俊，3

（1. 廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廈門 361003；2. 福建省寧德市閩東醫(yī)院放射治療科，寧德 352000；3. 福建醫(yī)科大學(xué)附屬廈門第一醫(yī)院，廈門 361003）

乳腺癌具有明顯的病理及分子特征異質(zhì)性，基因表觀遺傳在其中可能起重要作用［1］。利用甲基化芯片比較正常乳腺及乳腺癌組織，發(fā)現(xiàn)后者存在大量表觀基因改變［2］，提示表觀遺傳學(xué)事件在乳腺癌中可能具有重要作用。研究證實(shí)，基因啟動子甲基化可通過影響細(xì)胞周期（如CCND2、CKN2A）、DNA修復(fù)（如BRCA1、GSTP1）、凋亡（如BCL2、DAPK）、侵襲和轉(zhuǎn)移（如RASSF1A、RARβ、TWITE、HIN1）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控（如HOXA 5）、細(xì)胞粘附（如CDH1）以及激素介導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)（如ERα、ERβ）等機(jī)制影響乳腺癌發(fā)生發(fā)展［3］。

ST5發(fā)現(xiàn)于篩選的HeLa細(xì)胞癌基因cDNA文庫，是Hela/成纖維細(xì)胞雜交系統(tǒng)中差異表達(dá)的調(diào)控基因［4］。ST5又稱為DENND2B，基因位于11號染色體短臂15.4位置，序列全長為217601bp，其中包含38個(gè)外顯子。ST5開放閱讀框片段長3414bp，可編碼1137個(gè)氨基酸。ST5基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄形成三種大小不同的mRNA，分別編碼分子量為126、82和70 kDa的蛋白亞型P126、P82和P70。已發(fā)現(xiàn)P126在MCF10A細(xì)胞上與Rab13結(jié)合，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞遷移及其致瘤表型［5-6］。ST5可抑制宮頸癌，但其在乳腺癌中的作用仍未知。本研究旨在通過探究ST5在乳腺癌中的作用及其潛在分子機(jī)理，為后續(xù)開發(fā)靶向藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料菌株E.coli DH5α和質(zhì)粒PCDNA3.1、PCDNA3.1-ST5（ST5）以及人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、MDA-MB-231、BT-549、MDA-MB-468為本課題組持有。人乳腺癌組織樣本由我院乳腺外科提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，內(nèi)含100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素。置于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）提取新鮮乳腺癌和癌旁組織以及乳腺癌細(xì)胞總RNA。取2μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測GAPDH和ST5表達(dá)水平。GAPDH上游引物序列為5’-GTGACTAACCCTGCGCTCC-3’，下游引物序列為5’-GAACATGTAAACCATGTAGTTGAGG-3’；ST5上游引物序列為5’-TACCTCCCCGAAGTCTCCTA C-3’，下游引物序列為5’-ACTTGGCAGTAAGCGCCTG-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5 s，60℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，60℃延伸30 s，95℃變性30 s，循環(huán)1個(gè)周期。反應(yīng)結(jié)束后行2-△△Ct公式分析ST5 mRNA相對表達(dá)水平。

1.2.3 甲基化特異性PCR（methylation special PCR，MSP）提取乳腺癌細(xì)胞以及新鮮乳腺癌和癌旁組織總DNA，取1μg總DNA進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化及DNA純化后獲得甲基化DNA。以300ng甲基化DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過MemthPrimer軟件設(shè)計(jì)5對ST5的甲基化特異引物（表1）。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸20s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min，循環(huán)1個(gè)周期。反應(yīng)結(jié)束后行瓊脂糖凝膠電泳，采用Quantity One 4.6.2軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

表1 MSP引物序列

1.2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞根據(jù)質(zhì)粒提試劑盒說明書等常規(guī)操作進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并經(jīng)WB和qPCR實(shí)驗(yàn)鑒定后篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株MDA-MB-468/PCDNA3.1-ST5和MDA-MB-468/ PCDNA3.1。

1.2.5 siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺細(xì)胞MCF7接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)匯合度達(dá)30%時(shí)分成兩組，根據(jù)EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染說明書，分別加入適量質(zhì)粒稀釋液，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.6 CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后每孔加入10μL CCK8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)孵育3h，用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測波長450nm處各孔的光密度（D）值，以D值表示細(xì)胞增殖活力。

1.2.7 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種12孔板，培養(yǎng)48h后收集，PBS漂洗2次后，加入RNase A于30 ℃反應(yīng)25 min，再加入PI于室溫條件下反應(yīng)25min，最后上流式細(xì)胞儀檢測并自動分析制圖。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡（WESTERN BLOT）一抗為（ST5的稀釋比例為1∶500；GAPDH、JNK、P-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38和β-tubulin的稀釋比例為1∶1000），按照相關(guān)實(shí)驗(yàn)常規(guī)操作。采用Quantity One 4.6.2軟件對各組電泳條帶進(jìn)行灰度值分析，并與內(nèi)參做比值，統(tǒng)計(jì)各目標(biāo)蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.9 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)20只4～5周雌性Balb/c裸鼠于廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)。穩(wěn)轉(zhuǎn)的上述兩組細(xì)胞皮下接種于裸鼠左前肢腋窩處；每6天監(jiān)測腫瘤大小和裸鼠體重，40天后處死小鼠，取出腫瘤組織。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)學(xué)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ST5在乳腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)通過WESTERN BLOT、qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相比癌旁組織，乳腺癌組織中ST5蛋白和mRNA表達(dá)水平均較低（圖1）。

圖1 ST5在乳腺癌組織低表達(dá)。（A）WESTERN BLOT實(shí)驗(yàn)檢測ST5蛋白水平，（B）qPCR實(shí)驗(yàn)檢測ST5 mRNA水平。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。P：癌旁組織，T：乳腺癌組織。

WESTERN BLOT及qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與 MCF-7相比，惡性程度較高的MDA-MB-468細(xì)胞ST5蛋白和mRNA表達(dá)水平均較低（圖2）。因此我們分別選用MDA-MB-468和MCF-7細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)生物功能和分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)。

圖2 乳腺癌細(xì)胞中ST5蛋白和mRNA表達(dá)水平。（A）WESTERN BLOT實(shí)驗(yàn)檢測ST5蛋白表達(dá)，（B）qPCR實(shí)驗(yàn)檢測ST5 mRNA表達(dá)水平。**P＜0.01。

2.2 探究乳腺癌低表達(dá)ST5的機(jī)制

2.2.1 乳腺癌中ST5基因高甲基化狀態(tài)前期甲基化芯片數(shù)據(jù)分析提示，乳腺癌中ST5低表達(dá)可能由于ST5基因發(fā)生了甲基化。為驗(yàn)證之，采用甲基化特異性PCR（MSP）實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468中ST5啟動區(qū)5’CPG島甲基化狀態(tài)。凝膠電泳結(jié)果顯示第1-4對引物中M引物PCR擴(kuò)增出條帶，而非甲基化引物（U）則無，第5對U引物顯示有微弱的條帶，表明MDAMB-468中ST5基因啟動區(qū)發(fā)生高甲基化（圖3A）。用其中一對甲基化引物進(jìn)行MSP實(shí)驗(yàn)檢測4對乳腺癌組織/癌旁組織ST5的甲基化狀態(tài)，結(jié)果顯示第1、3、4對癌旁組織（P）有M和U條帶擴(kuò)增，癌組織（T）則具有明顯的M擴(kuò)增條帶以及條帶很弱或無U條帶擴(kuò)增；第2對癌旁組織（P）只有U條帶擴(kuò)增，癌組織（T）則兩種條帶均有擴(kuò)增；說明癌旁組織ST5基因低甲基化或非甲基化，而乳腺癌組織ST5基因發(fā)生高甲基化（圖3B）。

圖3 MSP實(shí)驗(yàn)檢測基因啟動子甲基化狀態(tài)。（A）乳腺癌細(xì)胞MDAMB-468的ST5甲基化水平，其中數(shù)字1/2/3/4/5表示第1/2/3/4/5對甲基化和非甲基化引物；（B）乳腺癌組織（T）/癌旁組織（P）ST5甲基化水平。其中數(shù)字1/2/3/4分別表示第1-4對T和P。M代表甲基化引物，U代表非甲基化引物。

2.2.2 檢測去甲基化藥物對乳腺癌細(xì)胞ST5表達(dá)水平的影響運(yùn)用不同濃度去甲基化試劑5-雜氮-2’-脫氧胞苷（5-aza）處理乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468，發(fā)現(xiàn)隨著5-aza濃度的增加，ST5表達(dá)量依次遞增（圖4），表明乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-468中ST5基因發(fā)生高甲基化。

圖4 不同濃度去甲基化試劑5-aza處理MDA-MB-468后，WESTERN BLOT 和qPCR實(shí)驗(yàn)檢測ST5蛋白及mRNA表達(dá)水平。*P＜0.05。

2.3 ST5影響乳腺癌細(xì)胞增殖利用MDA-MB-468和MCF-7細(xì)胞分別構(gòu)建ST5過表達(dá)（ST5）細(xì)胞和ST5敲減細(xì)胞（SIST5）模型。用CCK8實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h后細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示上調(diào)ST5抑制MDA-MB-468細(xì)胞增殖（圖5A），下調(diào)ST5促進(jìn)MCF-7細(xì)胞增殖（圖5B）。

圖5 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖。（A）ST5過表達(dá)的MDA-MB-468細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞（PCDNA3.1），（B）ST5敲減的MCF-7及其對照組細(xì)胞（SINC）。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

2.4 ST5影響乳腺癌細(xì)胞凋亡凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)ST5，早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞分別從3.68%、4.08%增加到10.00%、11.3%，統(tǒng)計(jì)總凋亡率從7.76%增加到21.3%（圖6A）；下調(diào)ST5，早凋細(xì)胞和晚凋細(xì)胞分別從5.66%、8.59%下降到2.50%、3.37%，統(tǒng)計(jì)總凋亡率從14.25%下降到5.87%（圖6B）。表明上調(diào)ST5可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)ST5則抑制其凋亡。

圖6 雙染FITC-Annexin-V/PI實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞的凋亡。（A）過表達(dá)ST5和PCDNA3.1空載細(xì)胞的凋亡率，（B）為統(tǒng)計(jì)（A）中凋亡細(xì)胞的總百分比；（C）SIST5和對照細(xì)胞SINC的凋亡率，（D）為統(tǒng)計(jì)（C）中凋亡細(xì)胞的總百分比。*P＜0.05，***P＜0.001。

2.5 過表達(dá)ST5抑制乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力利用前述構(gòu)建的MDA-MB-468乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示過表達(dá)ST5抑制裸鼠移植腫瘤的生長（圖7）。

圖7 過表達(dá)ST5抑制Balb/c雌裸鼠移植瘤的生長。（A）過表達(dá)ST5的乳腺癌細(xì)胞及其對照細(xì)胞（PCDNA3.1）在裸鼠皮下生長情況；（B）取出移植瘤并稱重，（C）接種10天后開始測量移植瘤的直徑（長和寬），每6天測量1次。根據(jù)公式計(jì)算腫瘤體積V=（長×寬2）/2，（D）統(tǒng)計(jì)對比移植瘤的重量。*P＜0.05，**P＜0.01。

2.6 探究ST5發(fā)揮抑癌功能的分子機(jī)制采用WESTERN BLOT檢測MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白（ERK1/2、JNK、P38等）的表達(dá)和活性。結(jié)果顯示，過表達(dá)ST5抑制了ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平；反之，抑制ST5表達(dá)則促進(jìn)了ERK1/2和JNK蛋白的磷酸化，但ERK1/2和JNK的蛋白表達(dá)水平則無明顯差異。但是，兩種情況下，P38蛋白的表達(dá)和磷酸化水平均無明顯變化（圖8）。表明ST5可能通過抑制MAPK-ERK1/2和MAPK-JNK信號通路發(fā)揮抑癌功能。

圖8 WESTERN BLOT實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)ST5（A）或抑制ST5（B）對乳腺癌細(xì)胞MAPK信號通路（ERK1/2、JNK、P38）相關(guān)蛋白表達(dá)和磷酸化水平的影響。

3 討論

本研究首次發(fā)現(xiàn)ST5在乳腺癌中低表達(dá)，并通過使用去甲基化藥物和甲基化特異性PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)了其原因可能為ST5基因啟動子區(qū)發(fā)生高甲基化。進(jìn)一步通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、凋亡實(shí)驗(yàn)和裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)等，系統(tǒng)揭示了ST5在體內(nèi)外抑制乳腺癌的生物學(xué)功能。

MAPK可調(diào)節(jié)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖、代謝、凋亡與免疫防御等生理過程［7-8］，其三級酶聯(lián)反應(yīng)包括：由MAPKKK使磷酪氨酸和磷蘇氨酸殘基脫磷，激活MAPKK，然后激活下游的MAPK［9］。MAPK家族成員包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-JUN N端蛋白激酶（JNK）和P38，因此MAPK信號通路主要包括ERK1/2、p38 和JNK1/2三條信號通路［10］。ST5蛋白的三個(gè)亞型共有一個(gè)C端區(qū)域，可與一組GDP/GTP交換蛋白質(zhì)的Rab3家族的小GTP結(jié)合蛋白結(jié)合。ST5的全長產(chǎn)物P126蛋白質(zhì)序列包含P-X-S/T-P擴(kuò)展膜體，是MAPK磷酸激酶的最佳結(jié)合位點(diǎn)［11］。有文獻(xiàn)報(bào)道，在宮頸癌中P126蛋白與c-Abl SH3結(jié)合，從而激活了MAPK/ERK 2信號通路，但ST5的另一產(chǎn)物P70則干擾c-Abl-P126復(fù)合物從而協(xié)同激活ERK2的活化［12］。本研究結(jié)果表明過表達(dá)ST5可下調(diào)ERK1/2和JNK蛋白磷酸化水平，而ERK1/2和JNK蛋白表達(dá)水平無明顯改變，提示過表達(dá)ST5抑制了ERK1/2和JNK的磷酸化。我們推測ST5通過 N 端兩個(gè)富含脯氨酸基序，與 GEF 競爭性結(jié)合銜接蛋白的 SH3 結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而抑制下游的 ERK1/2 和JNK磷酸化，以封閉 MAPK 信號傳遞，從而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑癌基因的生物學(xué)作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實(shí)ST5具有抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)功能及其潛在的分子機(jī)制。