朱樂玫,周夢穎,周科諭,張 遠,劉 娟
(長沙醫(yī)學院,長沙 410219)
反式脂肪酸(Trans Fatty Acids,TFA)是不飽和脂肪酸,它的主要結構是一個獨立反式構型雙鍵。我們日常生活中所攝入的反式脂肪酸主要來源于氫化植物油、人造奶油、起酥油、煎炸油等食物[1-2]。目前,大量研究表明過量攝入含TFA食品會危害人體健康,主要表現(xiàn)為心血管方面及導致肝臟脂肪堆積,肝細胞變性等多器官組織的損傷作用[3]。因此尋找安全、有效易被人們接受的天然藥物來保護TFA對人體所造成的各種慢性疾患成為了近年人們關注的焦點。川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)是從傳統(tǒng)中藥材川芎中提取得到的活性生物堿。研究發(fā)現(xiàn),TMP可起到有效清除自由基、抗炎等生物活性的作用[4-5]。本研究以川芎嗪為干預物,觀察其對TFA致大鼠肝臟損傷的保護效果,并探討其可能的作用機制,為川芎嗪應用臨床提供理論依據(jù)。
1.1 主要試劑與儀器反式脂肪酸(Trans Fatty Acids,TFA)油劑,(上海銳聰科技發(fā)展有限公司),純度>95%;川芎嗪(Tetramethylpyrazine,TMP)粉劑(美國Sigma公司),純度>95%;大鼠超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、大鼠丙二醛(Malonaldehyde,MDA)試劑盒(南京建成生物有限公司);CK40光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司),7170A全自動生化分析儀(日本Hatachi公司),RM2245型石蠟切片機(德國Leica公司)。1.2 實驗動物健康SPF級6月齡SD大鼠40只,雌雄各半,體重170~210g。由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號:SCXK[湘]2019-0004。動物在實驗專用飼養(yǎng)房標準條件下飼養(yǎng),室溫250C左右,相對濕度50%~70%,光照吋間12 h/12 h明暗交替,動物自由進食飲水。
1.3 動物分組與處理40只SD大鼠適應性喂養(yǎng)一周后,隨機分成5組:對照組、TFA染毒組(模型組)、TMP低、中、高劑量干預組組,每組6只(雌雄各半);對照組大鼠灌胃生理鹽水,模型組大鼠與各TMP干預組大鼠灌胃100 mg/kg劑量TFA,低、中、高劑量TMP干預組大鼠分別腹腔注射25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg劑量TMP,上午每組大鼠灌胃同劑量的TFA,灌胃體積為10mL/kg.bw,下午各干預組分別腹腔注射設計劑量的TMP,實驗時間8周,觀察大鼠生長情況;末次灌胃后禁食12h,稱體重,麻醉后處死大鼠,取血、摘取大鼠肝臟待測相關指標。
1.4 指標與方法
1.4.1 肝臟臟器系數(shù)檢測處死大鼠后,打開腹腔快速取出肝臟剝去附著筋膜和脂肪,生理鹽水漂洗、濾紙吸干用電子分析天平準確稱取肝臟重量,計算肝臟臟器系數(shù):
1.4.2 大鼠血清(肝功能)生化指標的檢測取出-800C保存的大鼠血清,室溫置靜待其溶解,使用日本7170A全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清ALT、AST、TP、ALB含量和A/G等肝功能指標。
1.4.3 大鼠肝組織SOD活性及MDA含量的檢測每鼠均摘取肝臟右葉,用生理鹽水漂洗去血,濾紙吸干,電子天平稱重后立即轉移至加入生理鹽水的玻璃勻漿器中,按重量(g):體積(mL)為1:9的比例用加4℃生理鹽水在冰浴下制備10%肝勻漿,于3000rpm,4℃離心10min,取上清。采用考馬斯亮蘭法測定肝組織蛋白含量;黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性,硫代巴比妥酸法(TBA法)測定MDA含量,均嚴格按照試劑盒說明書方法進行操作。
1.4.4 大鼠肝臟病理學觀察每鼠均摘取肝臟左葉置10%福爾馬林中固定24h,乙醇梯度脫水,二甲苯透明、浸蠟、常規(guī)石蠟包埋、切片、考片、脫蠟、梯度酒精脫水、HE染色,置光學顯微鏡下觀察其病理形態(tài)學變化。
1.4.5 大鼠肝臟透射電鏡觀察從肝臟右葉切取1mm3組織塊,放入2.5%戊二醛及磷酸緩沖液40C固定2 h;0.1M磷酸緩沖液漂洗3次;1%鋨酸40C固定1~2 h;固定后的切片用0.1M磷酸緩沖液漂洗3次;以梯度濃度的丙酮和乙醇進行脫水,環(huán)氧樹脂Epon812進行包埋;包埋后分別置于370C烘箱內12h、600C烘箱內12~24h進行固化;用超薄切片機切片后,使用醋酸鈾及硝酸鉛染色。透射電子顯微鏡下觀察肝臟細胞和亞細胞結構。
1.5 統(tǒng)計分析本實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量數(shù)據(jù)采用mean±SD表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.1 川芎嗪對TFA染毒大鼠生長的影響實驗期間,TFA染毒組(模型組)大鼠終試平均體重增長均高于對照組(P<0.05);經(jīng)中、高劑量TMP保護后其體重較模型組有明顯下降,呈恢復趨勢。各實驗組,除模型組大鼠體重增長快,皮下脂肪增厚,后期出現(xiàn)毛發(fā)蓬松,色澤暗淡、精神狀態(tài)差、活動量減少外,其余各組大鼠活動均正常,皮毛清潔,無豎毛、腺體分泌等異常改變,無動物死亡的現(xiàn)象。
2.2 川芎嗪對TFA染毒大鼠肝臟臟器系數(shù)的影響由表1所示:TFA染毒組大鼠肝臟臟器系數(shù)高于對照組(P<0.05);經(jīng)中(50mg/kg)、高(100mg/kg)劑量TMP保護后其肝臟臟器系數(shù)較模型組降低(恢復),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而低(25mg/kg)劑量TMP保護組與模型組比較其肝臟臟器系數(shù)降低不明顯(P>0.05)。
表1 TMP對TFA染毒大鼠肝臟臟器系數(shù)的影響
2.3 川芎嗪對TFA染毒大鼠肝臟病理形態(tài)的影響對照組大鼠肝臟組織結構正常,中央靜脈、肝竇、肝索結構清晰,未見明顯變性、壞死及炎癥細胞浸潤(圖1-A);TFA染毒組大鼠肝細胞中央靜脈及肝竇擴張,肝索排列紊亂,胞漿疏松化和氣球樣變、脂肪變性、壞死并伴有大量炎性細胞浸潤等病變(圖1-B);TMP保護組大鼠,肝組織結構有所恢復;炎性浸潤、肝細胞水變性、脂肪變性、灶性壞死明顯減輕,其中高劑量TMP保護組其病理形態(tài)改善較明顯(圖1-C、1-D、1-E)。
圖1 TMP對TFA染毒大鼠肝臟病理形態(tài)的影響(×400,HE)
2.4 川芎嗪對TFA染毒大鼠肝臟組織超微結構的影響電鏡下觀察,對照組大鼠肝臟組織結構清晰,其形態(tài)結構基本正常,可見線粒體、內質網(wǎng)、核糖體等細胞器,線粒體發(fā)達,嵴稀疏短小,粗面內質網(wǎng)(rough endoplasmic reticulum,RER)呈層狀排列緊密,細胞質內可見溶酶體(圖2-A);TFA染毒組大鼠肝細胞出現(xiàn)擠壓變形、空泡、崩解、壞死,胞漿內有大量形態(tài)不一的脂滴沉積,線粒體腫脹、RER擴張明顯,部分可見到肝巨噬細胞(kupffer cell)體積增大,吞噬脂滴數(shù)量較多,且溶酶體數(shù)量增多(圖2-B);各TMP干預組大鼠,肝組織結構病變均有所改善;肝細胞內空泡、脂滴明顯減少,線粒體腫脹、RER擴張明顯恢復,kupffer cell內吞噬脂滴數(shù)量較少,其中高劑量TMP保護組其超微結構改善較明顯(圖2-C、2-D、2-E)。
圖2 TMP對TFA染毒大鼠肝臟組織超微結構的影響(TEM×20000)
2.5 川芎嗪對TFA染毒大鼠血清(肝功能)生化指標變化的影響由表2所示:與對照組比較,模型組大鼠血清ALT、AST含量明顯增加,而其血清TP 、ALB含量和 A/G則明顯降低(P<0.05);與模型組比較,川芎嗪(TMP)中、高劑量組大鼠血清ALT、AST含量呈明顯降低趨勢,而其血清中TP、ALB含量和A/G比值均有不同程度的增加,差別均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,TMP低劑量組對大鼠血清ALT、AST含量的降低和對TP、ALB含量和A/G比值的增加均不明顯(P>0.05)。
表2 TMP對TFA染毒大鼠血清生化指標變化的影響(n=8)
2.6 TMP對TFA染毒大鼠肝組織SOD活性及MDA含量的影響由表3所示:與對照組比較,模型組大鼠肝組織SOD活性下降,MDA含量升高(P<0.05);與模型組比較,中、高劑量TMP保護組大鼠肝組織SOD活性增加,MDA含量降低,并與TMP保護劑量增加其恢復趨勢越明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與模型組比較,TMP低劑量保護組對大鼠肝組織SOD活性增加及MDA含量的降低均不明顯,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
表3 TMP對TFA染毒大鼠肝組織SOD活性及MDA含量的影響
肝臟臟器系數(shù)的變化能較好地反映毒物對肝臟的綜合毒性作用,其異常改變可作為病理組織學變化、毒理學效應指標的佐證。本實驗結果顯示,TFA染毒組大鼠肝臟臟器系數(shù)增高,其肝臟的病理形態(tài)結構出現(xiàn)肝細胞內空泡、水變性、炎癥浸潤、脂滴沉積等病變。證明TFA致肝臟器系數(shù)增加與其病理形態(tài)、超微結構變化呈一致;經(jīng)中、高劑量TMP保護后發(fā)現(xiàn)隨其肝臟臟器系數(shù)變小而肝臟病理形態(tài)、超微結構均有明顯改善,說明給予一定劑量的TMP保護可改善TFA引起的肝臟的損傷作用。
研究報道,具有一定蓄積作用的化學物進入機體后,會造成不同程度的肝臟損傷,主要為肝實質細胞損傷壞死[6]。本實驗結果顯示:TFA染毒大鼠血清ALT、AST含量均升高。這可能與TFA對引起的脂質過氧化作用增強,肝微粒體脂質、自由基與蛋白質發(fā)生共價結合,損傷肝細胞膜功能與結構的完整性有關[7-8];光鏡下、透射電鏡下觀察形態(tài)結構改變與血液生化指標變化相符,經(jīng)不同劑量TMP保護后其血清中ALT、AST含量均有不同程度的下降(恢復),其肝組織病理形態(tài)、超微結構(線粒體、RER、kupffer cell)出現(xiàn)明顯改善,提示TMP對TFA染毒致肝酶學改變、肝組織形態(tài)和超微結構損傷有不同程度的保護(恢復)作用。
當肝臟是人體脂質代謝的重要器官,肝細胞合成蛋白質的功能減退時,血清中蛋白質的質量會發(fā)生變化[9-10];本實驗結果顯示:TFA染毒大鼠血清TP、ALB和A/G比值均有不同程度降低與文獻報道相一致。進一步說明TFA能致實驗SD大鼠肝臟損傷。經(jīng)TMP保護后,其血清TP、ALB和A/G比值均有不同程度的升高。提示TMP能改善或恢復TFA中毒大鼠肝功能,并呈一定的劑量-效應關系。
目前,TFA致病機制的自由基學說受到更多的關注。現(xiàn)有的國內外不同研究學者的實驗結果多為一致:TFA對染毒動物均有使抗氧化酶SOD活性下降,脂質過氧化產物MDA增高,認為TFA通過誘導機體產生活性氧和自由基造成氧化損傷[11-14]。本實驗結果顯示,TFA染毒大鼠肝臟SOD活性下降,MDA含量升高。由此判斷TFA大鼠受自由基損傷的程度增加,機體抗氧化能力受到損傷;經(jīng)TMP保護后肝臟抗氧化酶SOD活性均有不同程度的升高,其氧化產物MDA含量均有出現(xiàn)下降的趨勢。說明TMP在一定程度上修復了機體的抗氧化能力,降低了TFA對肝細胞的氧化損傷作用。由于實驗條件所限,本研究仍有很多局限與不足,如對肝功能保護作用的分子機制等,這些都尚待在今后的基礎研究和臨床應用中進一步研究解決。本實驗證實了TMP對TFA所致的肝臟損傷具有保護作用,其機制可能與其抗氧化相關。