豆文文，宋桂華，張巖，孫萌萌，張冰雪…，趙鄭琦

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

0 引言

新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）簡(jiǎn)稱新冠肺炎，是由新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）引起的急性感染性疾病，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、干咳等癥狀，嚴(yán)重者可快速進(jìn)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥、休克等[1]，因其傳染性強(qiáng)、人群普遍易感等特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前本病治療以廣譜抗病毒和對(duì)癥支持治療為主，尚缺乏特異性藥物[2]，在此背景下，中醫(yī)方案的制定與實(shí)施在疫情防治中發(fā)揮了積極作用，其縮短病程、防止病情惡化、促進(jìn)肺炎康復(fù)等優(yōu)勢(shì)逐漸被重視[3]。

宣白承氣湯出自《溫病條辨》，為吳鞠通所創(chuàng)八大承氣新方之一，由生石膏、生大黃、瓜蔞皮、杏仁4味藥物組成，具有宣肺通腑功效，是新冠肺炎常用方劑之一[4-5]，但由于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑及靶點(diǎn)之間相互作用的特點(diǎn)，使宣白承氣湯對(duì)COVID-19作用機(jī)制缺乏系統(tǒng)性及整體性研究，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展為此提供了契機(jī)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的概念由Andrew L Hopkins于2007年首次在Nature Biotechnology上撰文明確[6]，隨后將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為“下一代藥物研發(fā)模式”進(jìn)行闡述[7]，該研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)從整體的角度去診治疾病的理論，中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同作用的原理殊途同歸[8]，因而迅速被應(yīng)用于尋找中藥作用靶點(diǎn)、相關(guān)疾病藥理機(jī)制等相關(guān)領(lǐng)域的研究中。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選宣白承氣湯的主要活性成分并以此為研究對(duì)象，探討其治療COVID-19的作用機(jī)制，為后續(xù)臨床及實(shí)驗(yàn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 宣白承氣湯化學(xué)成分的收集及篩選

基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[9]（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.ph）檢索杏仁、大黃的化學(xué)成分，篩選同時(shí)滿足ADME參數(shù)口服生物利用度（OB≧30%）和類藥性（DL≧0.18）的化學(xué)成分；通過中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[10]（TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/）獲取石膏和瓜蔞皮的化學(xué)成分，保存化學(xué)成分的Canonical SMILES結(jié)構(gòu)，對(duì)于數(shù)據(jù)庫(kù)無法提供SMILES結(jié)構(gòu)的成分，通過ALOGPS2.1（http://www.vcclab.org/lab/alogps/）計(jì)算獲得，建立宣白承氣湯主要有效成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 主要有效成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

Swiss Target Prediction數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.swiss target prediction.ch/）基于已知配體的2D和3D相似性度量的組合來預(yù)測(cè)生物活性分子目標(biāo)[11]，本研究通過該數(shù)據(jù)對(duì)瓜蔞皮、苦杏仁、大黃3味藥物的主要化學(xué)成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，條件限定為 Homo sapiens，選取Probability>0的靶標(biāo)結(jié)果，石膏的化學(xué)成分靶點(diǎn)通過DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cpi.bio-x.cn/drar/）預(yù)測(cè)獲取，篩選Z-score<-0.5的靶標(biāo)。由于檢索到的成分靶點(diǎn)存在命名不規(guī)范的情況，故將篩選所得靶點(diǎn)統(tǒng)一在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）進(jìn)行校正和轉(zhuǎn)化，并以Swiss-Prot ID表示，去除重復(fù)項(xiàng)，建立宣白承氣湯4味中藥的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 疾病靶點(diǎn)的獲得

以“novel coronavirus pneumonia”為 檢 索 詞，從 Gene Cards數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https://www.genecards.org/） 及 OMIM 數(shù) 據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）獲得新冠肺炎疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將疾病靶點(diǎn)Gene name校正為官方名稱，即Swiss-Prot ID，重復(fù)靶點(diǎn)僅保留1個(gè)，與1.2所得藥物預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，通過在線軟件繪制韋恩圖（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），即得到宣白承氣湯治療新冠肺炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)。

1.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將宣白承氣湯治療新冠肺炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/），限定物種為 Homo sapiens，獲得蛋白相互作用數(shù)據(jù)TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape3.2.1軟件繪制蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并通過其Network Analysis功能計(jì)算拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)Degree值調(diào)整節(jié)點(diǎn)大小和顏色，篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 生物過程與通路富集分析

為獲得宣白承氣湯治療新冠肺炎核心靶點(diǎn)的基因功能和主要作用通路，將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1的Clue GO插件進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）分析和KEGG通路富集分析，設(shè)置P≦0.01，獲取顯著性較高的生物過程和通路富集結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 宣白承氣湯活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

TCMSP和TCMID數(shù)據(jù)庫(kù)共收錄宣白承氣湯化學(xué)成分215個(gè)，符合篩選條件的共有45個(gè)，其中苦杏仁19個(gè)、大黃16個(gè)、瓜蔞皮9個(gè)、石膏1個(gè)，將主要化學(xué)成分Canonical SMILES結(jié)構(gòu)上傳至Swiss Target Prediction及DRAR-CPI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，并根據(jù)P值及Z-score值篩選、重復(fù)靶點(diǎn)保留1個(gè)，共得到預(yù)測(cè)靶點(diǎn)704個(gè)，主要化學(xué)成分及靶點(diǎn)數(shù)目見表1。

表1 宣白承氣湯中主要化學(xué)成分及靶點(diǎn)數(shù)目

2.2 宣白承氣湯治療新冠肺炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)

通過GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)分別獲得新冠肺炎相關(guān)靶點(diǎn)259個(gè)、90個(gè)，取交集去重后獲得新冠肺炎相關(guān)靶點(diǎn)333個(gè)，與2.1所得的704個(gè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得66個(gè)交集靶點(diǎn)，即宣白承氣湯治療新冠肺炎的可能靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

將交集靶點(diǎn)通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape3.2.1軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，共65個(gè)節(jié)點(diǎn)，平均Degree值18.369，見圖2，圖中節(jié)點(diǎn)表示靶蛋白，邊表示相互作用，節(jié)點(diǎn)的顏色和大小表示Degree值的大小，顏色由綠色到紅色、節(jié)點(diǎn)由小到大表示Degree值逐漸增大，可得到蛋白結(jié)合較高的靶點(diǎn)如白介素6（IL6）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、半胱氨酸蛋白酶3（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、白介素4（IL4）等。宣白承氣湯治療新冠肺炎的66個(gè)靶蛋白中，65個(gè)靶蛋白與其他蛋白具有相互作用，與中藥復(fù)方靶點(diǎn)之間相互作用的特點(diǎn)相符。

圖2 宣白承氣湯蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 生物過程和通路分析

將宣白承氣湯與新冠肺炎共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.2.1的Clue GO插件，并根據(jù)P≤0.01篩選，獲得相關(guān)生物通路41條，主要涉及運(yùn)動(dòng)的正調(diào)節(jié)（positive regulation of locomotion）、活 性 氧 代 謝 過 程（reactive oxygen species metabolic process）、脂質(zhì)修飾（lipid modification）、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to oxidative stress）等，見圖3。KEGG通路富集涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、癌癥通路（Pathways in cancer）、原發(fā)性免疫缺陷（Primary immunodeficiency）、核 因 子 -κB信 號(hào) 通 路（NF-kappa B signaling pathway）等信號(hào)通路，見圖4。

圖3 宣白承氣湯治療新冠肺炎的GO生物過程

圖4 宣白承氣湯治療新冠肺炎的KEGG信號(hào)通路

3 討論

新冠肺炎屬于中醫(yī)學(xué)“疫”病范疇，疫毒犯肺，氣失宣降，肺津不布則痰涎壅滯，痰壅氣逆則喘促不寧，肺與大腸相表里，臟病及腑，陽明熱結(jié)則見大便秘結(jié)等癥狀。陽明腑實(shí)形成，疫邪有所依附，久戀不去，瘀閉肺絡(luò)及心包，從而出現(xiàn)呼吸困難、咯血等危急重癥，故治療上應(yīng)宣肺通腑瀉熱，肺腸合治[12]。宣白承氣湯是中醫(yī)“肺與大腸相表里”臟腑相關(guān)理論指導(dǎo)下“肺腸同治”的代表方劑之一[13]，方中石膏清泄肺熱，瓜蔞皮、杏仁既可宣降肺氣，又可通過宣降肺氣助腑氣通調(diào)，治上即可治下，大黃雖重在邪熱通便，亦可通過瀉下助肺氣下行，四藥合用，上宣肺氣，下通地道，臟腑并調(diào)，在新冠肺炎的治療中發(fā)揮重要作用，但其效應(yīng)機(jī)制尚不清楚，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，依托生物信息學(xué)及多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)初步探討宣白承氣湯治療新冠肺炎的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及關(guān)鍵通路。

本研究經(jīng)篩選獲取宣白承氣湯主要有效成分45個(gè)，可能是宣白承氣湯治療新冠肺炎的活性成分。新型冠狀病毒肺炎診療方案第七版中指出COVID-19患者可根據(jù)病情選擇抗病毒、抗菌、免疫支持等治療方案，抗艾滋病藥物洛匹那韋/利托那韋可用于COVID-19的治療,天花粉蛋白（trichosanthin）具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，趙巧云等[14]將人類免疫缺陷病毒1型在細(xì)胞系中培養(yǎng), 加入天花粉蛋白后觀察細(xì)胞病變情況，發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白在培養(yǎng)細(xì)胞系中可有效抑制人類免疫缺陷病毒1型。蘆薈大黃素、大黃素（Rhein）均具有抑菌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[15,16]，祁紅[17]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大黃素起效快,對(duì)炎癥早期的滲出、毛細(xì)血管通透性增高、白細(xì)胞游走等有較好的對(duì)抗作用, 對(duì)急性炎癥有明顯對(duì)抗作用。新冠肺炎部分患者在疾病發(fā)展過程中因炎癥風(fēng)暴的發(fā)生而出現(xiàn)免疫紊亂，研究發(fā)現(xiàn)[18]，新冠肺炎患者血清中IL-2、IL-6、TNF-α等多種細(xì)胞因子水平升高，蘆薈大黃素可通過抑制IL-2誘發(fā)的T細(xì)胞增殖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[19]，亦可降低血清中PAF、IL-6和TNF-α水平發(fā)揮抗炎作用[20]。β-谷甾醇（beta-sitosterol）和豆甾醇（Stigmasterol）均具有抗炎活性，β-谷甾醇可通過減少NO的合成，抑制巨噬細(xì)胞IL- 6活性，減少IL-1、TNF-α等炎性因子的分泌發(fā)揮抗炎作用[21]，豆甾醇能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的環(huán)氧合酶-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA和蛋白水平的提高，抑制前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮(NO)的釋放發(fā)揮抗炎作用[22]。綜上，宣白承氣湯中有效成分可能通過抗病毒、抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等途徑發(fā)揮治療新冠肺炎的作用。

宣白承氣湯治療新冠肺炎的靶點(diǎn)共66個(gè)，通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)我們獲得蛋白結(jié)合度較高的靶點(diǎn)如IL-6、EGFR、CASP3、MAPK1、MAPK3、MAPK8。急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是新冠肺炎病情進(jìn)展的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，ARDS死亡組患者血清中IL-6水平顯著升高[23-24]，故推測(cè)IL-6參與ARDS的發(fā)病過程，有研究表明[25]，在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上配合宣白承氣湯有助于改善患者的呼吸功能和呼吸力學(xué)參數(shù)，其機(jī)制可能與減輕全身炎癥反應(yīng)有關(guān)。此外，尚俊等[26]研究發(fā)現(xiàn)宣白承氣湯佐治ALI/ARDS的療效優(yōu)于單純西醫(yī)治療，可有效降低患者血清中CRP、IL-6、TNF-α和內(nèi)毒素水平的水平。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）是一種酪氨酸激酶受體，研究發(fā)現(xiàn)抑制EGFR活化能降低病毒的感染滴度[27]。Caspases 作為一類蛋白裂解酶，可被許多促凋亡因子（如細(xì)菌病毒感染、發(fā)熱或氧自由基等）所活化，半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）為最主要的凋亡調(diào)節(jié)因子[28]，炎性介質(zhì)阻斷劑可有效抑制CASP3的表達(dá)，減少凋亡細(xì)胞數(shù)量[29]。MAPK1、MAPK3、MAPK8為絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員，活化的MAPK可通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等參與細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡的調(diào)節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)[30]。

生物過程GO分析和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果顯示，宣白承氣湯可能通過多通路發(fā)揮治療新冠肺炎的作用?；钚匝醮x過程為富集程度較高的生物過程之一，活性氧在肺損傷中一方面可促進(jìn)黏蛋白的分泌，另一方面可起到炎癥反饋放大環(huán)和損傷血管內(nèi)皮作用[31]，研究證實(shí)在急性肺損傷中肺內(nèi)大量聚集在中性粒細(xì)胞，肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-κB被激活，采用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽等可抑制NF-κB的活化，同時(shí)也明顯改善肺部炎性損傷程度[32]。此外，NF-κB參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答、病毒復(fù)制等過程，在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)相關(guān)基因中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)[33]，重癥肺炎的病理生理學(xué)涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)，NF-κB是導(dǎo)致網(wǎng)絡(luò)激活、促進(jìn)重癥肺炎發(fā)展的中樞，通過阻斷NF-κB途徑可改善其異常的病理生理及預(yù)后。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對(duì)宣白承氣湯治療新型冠狀病毒肺炎的活性成分、靶點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討，但由于該研究數(shù)據(jù)均來源于已有的數(shù)據(jù)庫(kù)資源，且缺乏實(shí)驗(yàn)支持，后期可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)一步探索與驗(yàn)證。