劉姍姍，王凱，李慧，劉焱，李鞠，孟德釬，張鐘元

（南京醫(yī)科大學附屬淮安一院風濕免疫科，江蘇 淮安 223001）

0 引言

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是一種多因素參與的，累及全身多系統(tǒng)的自身免疫病，如未得到及時和有效的治療，會造成受累臟器的不可逆損害，最終導致患者死亡。狼瘡性腎炎(lupus nephritis, LN)是SLE的最主要并發(fā)癥和死亡原因，目前LN的主要治療手段為激素及免疫抑制劑，但上述藥物往往也帶來眾多的不良反應[1]。

中藥昆明山海棠是一種民間常用藥，在植物分類學上與雷公藤親緣關系接近，其臨床應用、毒性等也與雷公藤相似。因其在治療自身免疫性疾病方面相對雷公藤的作用更加緩和，被廣泛應用于類風濕關節(jié)炎[2]、銀屑病關節(jié)炎[3]等疾病的治療?！熬盼濉眹抑嗅t(yī)藥重點科技攻關項目成果-昆仙膠囊便是以昆明山海棠為主要成分。我們在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，昆仙膠囊聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療LN效果不劣于環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)；對女性卵巢功能損害與CTX 相當，消化、血液等系統(tǒng)不良反應較低[4]。但尚沒有研究能系統(tǒng)闡明昆仙膠囊治療LN的藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制。因此，本研究以中藥的多靶點整體調(diào)控為切入點，嘗試使用網(wǎng)絡藥理學方法，分析昆仙膠囊治療LN可能的藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫和軟件

中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫（TCMSP），在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM），人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫（GeneCards），Uniprot數(shù)據(jù)庫，蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫（STRING），Cytocape3.7.2軟件，R version 3.6.3軟件。

1.2 活性化合物的篩選

將昆仙膠囊成分昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子和菟絲子分別輸入TCMSP。昆仙膠囊為口服制劑，因此為了篩選潛在活性化合物，使用口服生物利用度（oral bioavailability, OB）和藥物相似性（drug-likeness, DL）篩選出合適的化合物。OB是指藥物經(jīng)口服給藥后藥物被機體吸收進入全身血液循環(huán)的相對量和速率，是決定生物活性分子類藥性的關鍵指標。因生物堿的OB較低，本研究選擇OB≥30%作為篩選條件。DL是指化合物與目前已知藥物的相似性，若DL≥0.18，則可認為該化合物與Drugbank數(shù)據(jù)庫里藥物具有一定的相似性。因此，本研究以OB≥30%及DL≥0.18的化合物視為潛在活性化合物進行進一步分析。

1.3 LN相關靶點篩選

為了收集LN相關靶點，將“l(fā)upus nephritis”作為關鍵詞在OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫進行檢索，下載LN相關靶點，并對收集的靶點信息進一步篩選，最終將獲得的靶點進一步映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫歸一化和標準化命名，最終整合并建立化合物-疾病靶點數(shù)據(jù)庫。

1.4 昆仙膠囊所含化合物的收集與篩選結果

篩選出昆仙膠囊的活性化合物共122個，其中昆明山海棠有效成分51個，淫羊藿15個，菟絲子11個，枸杞子45個。

1.5 網(wǎng)絡構建與分析

為了闡明昆仙膠囊的治療LN的機制，本研究構建了可視化網(wǎng)絡以更好的展示化合物-疾病靶點之間的相互作用。若某個化合物與疾病靶點之間存在一定的關系，則在網(wǎng)絡中顯示該化合物與靶點相連接。網(wǎng)絡圖利用Cytoscape 3.7.2構建?；衔锏墓?jié)點上代表了化合物對應的預測LN相關靶點的個數(shù)，節(jié)點的度數(shù)是與節(jié)點相連的邊的數(shù)量，度數(shù)越大，說明網(wǎng)絡中與該節(jié)點直接相關的節(jié)點數(shù)越多，表明該節(jié)點在網(wǎng)絡中的重要性越大，是化合物的關鍵作用靶點的可能性也就越大。以網(wǎng)絡節(jié)度(degree)≥10的靶點和成分，為復方的核心成分和關鍵靶點。

1.6 GO生物功能過程和KEGG代謝通路富集分析結果

本研究利用R軟件的clusterProfiler包對差異表達基因進行GO(gene ontology，GO) 功能注釋和KEGG(kyoto encyclopedia of gene and genome, KEGG)通路富集分析。本研究將篩選條件設定為校正后Padj<0.05。結果以氣泡圖或條形圖形式呈現(xiàn)，并根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度。

2 結果

2.1 昆仙膠囊活性化學成分及作用靶點預測

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到昆仙膠囊已知成分，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18篩選出昆仙膠囊的活性化合物共122個，其中昆明山海棠有效成分51個，淫羊藿15個，菟絲子11個，枸杞子45個。

2.2 LN相關靶點篩選

由TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到共3960個靶點蛋白，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶蛋白轉為對應的基因名稱后，與從OMIM及GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到的1259個LN相關基因進行對比，篩選得到107個昆仙膠囊治療LN的潛在靶點，獲得聯(lián)系其他靶點個數(shù)排名前30位的靶點如圖1所示。

圖1 昆仙膠囊中化合物的作用靶點分布

2.3 候選化合物-LN靶點網(wǎng)絡分析

運用Cytoscape對昆仙膠囊活性成分的治療LN靶點進行PPI 網(wǎng)絡構建，靶點之間的相互關系如圖2所示（黃色為degree10）。從蛋白靶點角度來看，degree10的靶點共14個，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2，degree=50)，PTGS1(degree=33)，過氧化物酶體增生激活受體γ(PPARG，degree=21)，毒蕈堿型乙酰膽堿受體M3(CHRM3，degree=19)，絲氨酸蛋白酶1(PRSS1，degree=18)，雌激素受體1(ESR1，degree=13)，一氧化氮合酶 2(NOS2，degree=13)，胱天蛋白酶3(CASP3，degree=12)等。從化合物角度來看，degree≥10的靶點共10個，槲皮素(degree=235)，山奈酚(degree= 88)，β- 谷 甾 醇 (degree= 37)，雷 公 藤 甲 素 (degree=29)，蜜 桔 黃素 (degree=20)，淫羊藿苷元 (degree= 12)，豆甾醇 (degree=11)，黃豆黃素(degree=10)，8-異戊烯基山奈酚(degree=10)，5,8-二羥基-7-（4-羥基-5-甲基-香豆粗-3-基）-香豆精(degree=10)，是昆仙膠囊治療LN較為重要的部分。

圖2 昆仙膠囊的化合物-靶點作用網(wǎng)絡

2.4 昆仙膠囊生物功能過程和代謝通路富集分析結果

通過R軟件的clusterProfiler軟件包對篩選出的差異表達基因進行GO功能注釋和KEGG通路富集分析.其中GO功能分析結果如圖3所示，差異表達基因主要定位于細胞因子受體結合、細胞因子活性、受體配體活性、核受體活性、轉錄因子活性等。KEGG通路富集分析結果顯示，差異表達基因主要參與糖基化終產(chǎn)物-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（Advanced Glycation Endproducts-Receptor of Advanced Glycation Endproducts, AGE-RAGE）、腫 瘤 壞 死 因 子（tumor necrosis factor, TNF）、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、白介素（Interleukin, IL）-17、Toll樣受體等信號通路(圖4)。其中最重要的AGE-RAGE通路如圖5所示。

圖3 昆仙膠囊活性化合物-LN潛在靶點生物學過程的GO分析

圖4 昆仙膠囊活性化合物-LN作用靶點的KEGG分析

圖5 昆仙膠囊在AGE-RAGE信號通路中的作用靶點

3 討論

雷公藤是迄今為止治療風濕免疫性疾病療效最為確切的一味中藥，用于 SLE、LN 治療已有40年的歷史[5]，但其對生殖系統(tǒng)的毒性作用限制了雷公藤類藥物的廣泛應用[6]。昆仙膠囊是雷公藤多甙片升級換代產(chǎn)品，由昆明山海棠、淫羊藿、枸杞子和菟絲子組方而成，具有祛風除濕、活血通絡、護腎等功效，且相對雷公藤而言，昆仙膠囊組方中的其他成分：淫羊藿[7]、枸杞子[8]和菟絲子[9]能夠拮抗雷公藤制劑所致的生殖毒性。本研究使用了網(wǎng)絡藥理學研究方法，對昆仙膠囊活性成分進行篩選，研究其多成分-多靶點-多通路作用機制，

以闡釋其治療LN的基本原理。首先，篩選得到122個昆仙膠囊的生物活性成分；其次，本研究共獲得LN相關靶點共計1259個，并構建相互作用網(wǎng)絡獲取相關靶點107個。關鍵靶點包括 PTGS2、PTGS1、NOS2、TNF、IL-6等，上述靶點均與LN的發(fā)生發(fā)展高度相關。

對靶點的富集分析結果顯示，昆仙膠囊治療LN的靶點可能與AGE-RAGE、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、Toll樣受體、IL-17、TNF等信號通路等密切相關，這些作用通路可能是昆仙膠囊發(fā)揮治療LN作用的依據(jù)。AGE-RAGE信號通路是本研究所得到的最關鍵通路，此通路在SLE及LN中的研究尚未見報道，但目前的研究顯示，高水平的AGE可通過RAGE引起足細胞凋亡，導致先天性免疫反應和足細胞凋亡[10]。通過抑制AGE-RAGE信號通路，能夠改善腎小球內(nèi)皮細胞及足細胞[11,12]，對腎臟有一定的保護作用[13]。

腎微血管病變普遍存在于LN的病理表現(xiàn)中，動脈粥樣硬化型是LN中較為常見的血管病變，與無腎微血管病變的狼瘡性腎炎患者相比，動脈粥樣硬化型患者的年齡偏大、血肌酐水平較高、平均動脈壓較高，并且腎臟病理上的慢性化指數(shù)更高[14]。流體剪應力來源于血液或尿液等流體流動產(chǎn)生的機械力，剪應力由流速、血管幾何形狀和流體粘度決定，可以調(diào)節(jié)組織形態(tài)發(fā)生[15]，特別是血管中的管腔直徑，它也有助于各種人類疾病的進展，如動脈粥樣硬化[16]。我們的研究顯示首次發(fā)現(xiàn)流體剪切應力與動脈粥樣硬化這一條信號通路可能也是昆仙膠囊治療LN的重要靶點之一。

皰疹病毒感染是SLE患者使用免疫抑制劑治療過程中的主要并發(fā)癥，尤其是在腎臟疾病患者中。在這種情況下，腎功能受損既是感染的罪魁禍首也是受害者[17]。我們的分析顯示了昆仙膠囊對LN中卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染這一條信號通路也有一定的作用。除上述信號通路以外，我們研究所提示的IL-17[18]、Toll樣受體[19]、TNF[20]等信號通路在各項研究中均提示了與LN的發(fā)生發(fā)展有關，針對以上信號通路的治療將給LN帶來益處。

以上研究均提示了，多條信號通路參與了LN發(fā)生發(fā)展的過程，緩解LN的治療可能需要多個靶點的聯(lián)合治療。系統(tǒng)性紅斑狼瘡具有多靶點、多環(huán)節(jié)的特點，昆仙膠囊富含多個有效成分，是治療LN的有效藥物。但同時，昆仙膠囊也正是因為成分較多、作用靶點多的特點，使得作用機制不明確，很難進行全面系統(tǒng)地研究。通過我們的研究，希望能夠為LN的治療提供新的思路。但這些結果都有待于通過藥理實驗進行驗證。未來有必要以本研究的預測結果為基本方向，通過設計相關實驗，驗證昆仙膠囊治療LN的具體機制。