趙恒宇，鄭浩青，黃河儒，李維嘉，吳振興

（杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

0 引言

肝癌已成為人類第四大死因，目前我國(guó)肝癌發(fā)患者數(shù)約占世界肝癌發(fā)患者數(shù)的50%[1,2]。肝癌病例中有75%-85%為肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，LIHC）[3]。乙肝病毒、丙肝病毒、酗酒和馬兜鈴酸是LIHC的危險(xiǎn)因素，這些因素將導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)激活、細(xì)胞死亡以及腫瘤進(jìn)展[4,5]。目前，LIHC缺乏早期診斷標(biāo)志物和特異性治療藥物[6]。

肺癌死亡率最高的癌癥，約85%的肺癌病例為非小細(xì)胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC），而肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是NSCLC中最常見(jiàn)的類型[7,8]。吸煙是肺癌的主要危險(xiǎn)因素[9,10]。由于目前醫(yī)療技術(shù)的局限，大量肺癌患者確診時(shí)已為晚期[11]。

結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶I（flap endonuclease 1，F(xiàn)EN1）基因定位于染色體11q12，在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組中起到重要作用[12,13]。有研究報(bào)道，F(xiàn)EN1過(guò)表達(dá)存在于多種腫瘤，提示FEN1過(guò)表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)[14]。已有META分析證明FEN1與LIHC及LUAD相關(guān)[15-17]。

本研究使用ONCOMINE、DriverDBv3、人類蛋白質(zhì)圖譜（The Human Protein Atlas，HPA）、GEPIA、Kaplan-Meier Plotter和UALCAN等數(shù)據(jù)庫(kù)和挖掘工具，探究FEN1表達(dá)在LIHC與LUAD中的預(yù)后價(jià)值。本研究也使用了STRING、Metascape、cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)等網(wǎng)絡(luò)工具對(duì)FEN1進(jìn)行蛋白互作分析、富集分析、突變分析。研究結(jié)果表明，F(xiàn)EN1是LIHC和LUAD的潛在診療與預(yù)后的生物標(biāo)志物。

1 方法

1.1 FEN1表達(dá)差異分析

ONCOMINE（https://www.oncomine.org）是一個(gè)癌基因和癌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[18]。為獲取FEN1在肝癌和肺癌中及正常組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)，我們?cè)O(shè)定數(shù)據(jù)將篩選條件如下：①Gene：FEN1；② Analysis Type：Cancer vs.Normal Analysis；③ Data Type: mRNA；④臨界值設(shè)定條件：P<0.01，F(xiàn)old Change>1.5，Gene Rank：10%。

DriverDBv3（http://driverdb.tms.cmu.edu.tw）是一個(gè)癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)[19]。本研究使用DriverDBv3分析FEN1基因在原發(fā)性LIHC和LUAD中表達(dá)與在正常樣本中表達(dá)的差異。

UALCA（http://ualcan.path.uab.edu）是一個(gè)交互式的癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄了癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）等多數(shù)據(jù)庫(kù)資源[20]。本研究使用UALCAN分析FEN1在正常樣品與腫瘤樣品中差異表達(dá)。

HPA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.proteinatlas.org）是一個(gè)旨在構(gòu)建細(xì)胞、組織、器官中蛋白質(zhì)圖譜的數(shù)據(jù)庫(kù)[21-23]。本研究從HPA中下載肝癌、肺癌組織，以及正常肝組織、肺組織中免疫組化圖片并對(duì)其進(jìn)行分析。

1.2 FEN1表達(dá)差異的生存分析

GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn/index.htmL）是一個(gè)聚合了腫瘤樣本和正常樣本的RNA測(cè)序表達(dá)的數(shù)據(jù)庫(kù)[24]。本研究利用GEPIA分析FEN1高表達(dá)與低表達(dá)對(duì)LIHC、LUAD患者生存的影響。

The Kaplan-Meier Plotter（https://kmplot.com/analysis）是一個(gè)評(píng)估基因表達(dá)或突變對(duì)患者生存的影響的在線工具[25-27]。本研究使用該數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證了FEN1表達(dá)水平高低對(duì)肝癌和肺癌患者生存的影響。

1.3 FEN1的蛋白互作分析、富集分析、突變分析

STRING（https://string-db.org）是一個(gè)分析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactions，PPI）的數(shù)據(jù)庫(kù)[28,29]。本研究使用STRING分析FEN1的20個(gè)相關(guān)蛋白的相互作用。

Metascape（https://metascape.org）是一個(gè)提供富集分析、PPI分析、基因注釋等功能的在線工具[30]。本研究將STRNG中獲取的20個(gè)FEN1相關(guān)蛋白進(jìn)行功能富集分析。

癌癥基因組學(xué)的生物門戶（cBioPortal for Cancer Genomics，cBioPortal）是一個(gè)多組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)[31]。本研究使用cBioPortal評(píng)估FEN1突變對(duì)于患者生存時(shí)間的影響。研究中將篩選數(shù)據(jù)的條件設(shè)定如下：①Genomic Profiles：Mutation，copynumber alterations from GISTIC，mRNA Expression z-Scores（RNASeq V2 RSEM）；② z-score threshold：±1.8。

2 結(jié)果

2.1 FEN1在正常與腫瘤組織中的表達(dá)差異

對(duì)ONCOMINE數(shù)據(jù)庫(kù)中肝癌和肺癌的芯片進(jìn)行分析。與正常組織相比，F(xiàn)EN1在肝癌與肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)（圖1A）。通過(guò)DriverDBv3分析，F(xiàn)EN1在原發(fā)性LIHC和LUAD中表達(dá)顯著高于正常組織（圖1B）。通過(guò)UALCAN數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)TCGA中樣本進(jìn)行定量分析（圖1C），F(xiàn)EN1在LIHC樣品中表達(dá)顯著高于正常組織（P<0.05），F(xiàn)EN1在LUAD樣品中表達(dá)也顯著高于正常組織（P<0.05）。通過(guò)分析HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫組化圖片，F(xiàn)EN1在肝癌與肺癌組織中均為高表達(dá)，在正常肝組織與肺組織中均為中表達(dá)（圖1D）[21-23]。因此，F(xiàn)EN1在LIHC與LUAD中均存在高表達(dá)情況。

圖1 FEN1在肝癌、肺癌、正常組織中表達(dá)差異分析

2.2 FEN1表達(dá)差異的生存分析

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果顯示，F(xiàn)EN1表達(dá)水平與LIHC和LUAD患者預(yù)后相關(guān)（圖2）。LIHC中FEN1高表達(dá)與患者總生存期（Overall Survival，OS）和無(wú)病生存期（Disease-Free Survival，DFS） 相 關(guān)（OS log-rankP=0.022，HR=1.5；DFS log-rankP=0.0075，HR=1.5）（圖2A、B）。LUAD 患者FEN1高表達(dá)與OS相關(guān)，但FEN1表達(dá)高低對(duì)DFS造成的差異無(wú)統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（OS log-rankP=0.027，HR=1.4；DFS log-rankP=0.63，HR=1.1）（圖2C、D）。

我們使用Kaplan-Meier Plotter驗(yàn)證GEPIA結(jié)果，LIHC中FEN1高表達(dá)與OS和DFS相關(guān)（OS log-rankP=3.4e?06，HR=2.28；DFS log-rankP=0.0095，HR=1.54）（圖2E、F）；LUAD患者FEN1高表達(dá)與OS和DFS也相關(guān)（OS log-rankP=0.00093，HR=1.66；DFS log-rankP=0.041，HR=1.75）（圖2G、H）。

圖2 FEN1表達(dá)差異的生存分析

綜合兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果，F(xiàn)EN1表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)LIHC和LUAD患者生存狀況的標(biāo)志物。

2.3 FEN1的PPI、富集、突變分析

通過(guò)STRING構(gòu)建了FEN1及20個(gè)相關(guān)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A），在Metascape中進(jìn)行了基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathways，KEGG）分 析（圖3B、C、D），F(xiàn)EN1及相關(guān)蛋白主要功能為DNA修復(fù)（GO：0006281）、DNA 鏈延伸（R-HSA-69190）、DNA 重組（GO：0006310）等功能。通過(guò)cBioPortal分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)EN1突變情況對(duì)LIHC患者的DFS長(zhǎng)短造成的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖3 FEN1的PPI分析和富集分析

3 討論

目前，肝癌和肺癌分別已成為中國(guó)人位居第三大、第五大的死因[32]。由于缺乏早期診斷標(biāo)志物、預(yù)后標(biāo)志物和靶向藥物，肝癌和肺癌患者生存期較短[6,11]。因而尋找肝癌和肺癌的標(biāo)志物及靶向藥物，是腫瘤研究領(lǐng)域亟待解決的問(wèn)題。

FEN1是5’核酸酶超家族成員，它參與了岡崎片段成熟、長(zhǎng)堿基切除修復(fù)RNA引物在后隨鏈復(fù)制中的移動(dòng)、維持端粒長(zhǎng)度等功能[33]。因此，F(xiàn)EN1為細(xì)胞正常運(yùn)行提供必要的支持。

本研究分析了FEN1在LIHC和LUAD中的功能、表達(dá)及預(yù)后價(jià)值。其中運(yùn)用了多組學(xué)對(duì)FEN1表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)FEN1在LUAD與LIHC中確實(shí)存在高表達(dá)。本研究還分析了FEN1表達(dá)高低對(duì)于患者生存期的影響。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)表明，F(xiàn)EN1高表達(dá)與LIHC預(yù)后不良相關(guān)；Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)表明，F(xiàn)EN1高表達(dá)與上述兩種癌癥預(yù)后不良都有相關(guān)性。綜上所述，F(xiàn)EN1表達(dá)水平也可作診斷與治療的潛在標(biāo)志物，可為醫(yī)生制定治療策略提供參考。研究也發(fā)現(xiàn)FEN1突變與LIHC患者無(wú)病生存期相關(guān)，提示FEN1突變情況可作為預(yù)測(cè)LIHC的潛在標(biāo)志物。

盡管本研究通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行多組學(xué)分析，但仍存在著局限性。一是，F(xiàn)EN1的mRNA 表達(dá)差異樣本量較??；二是沒(méi)有使用META分析對(duì)FEN1在LIHC和LUAD中診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。我們?cè)诮诰劢褂隗w外實(shí)驗(yàn)，以完善數(shù)據(jù)庫(kù)分析所存在的不足，期待更好地說(shuō)明FEN1表達(dá)與兩種類型惡性腫瘤的相關(guān)性。但總的來(lái)說(shuō)，F(xiàn)EN1可成為肝細(xì)胞肝癌和肺腺癌潛在的預(yù)后和診療生物標(biāo)志物。