湛 慧 陳秋玲 李 寬

(深圳市人民醫(yī)院藥學(xué)部 深圳 518000)

microRNAs是由20～23個(gè)核苷酸構(gòu)成的天然調(diào)節(jié)因子，它通過(guò)主抑制mRNA翻譯或促進(jìn)分解來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)作用。多項(xiàng)研究顯示，miRNAs在心血管領(lǐng)域特別是心肌纖維化方面發(fā)揮著重要作用[1～3]。miRNAs可激活多個(gè)通路，促正常成纖維細(xì)胞出現(xiàn)病理分化，觀察miRNA-21的表達(dá)水平以及纖維化標(biāo)志物的變化，發(fā)現(xiàn)Ⅰ型膠原與纖維連接蛋白呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[4]。miRNA-29b可對(duì)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、基質(zhì)金屬蛋白酶、I型膠原起到負(fù)性調(diào)節(jié)效果，而達(dá)到調(diào)節(jié)心肌纖維化進(jìn)程[5]。研究表明，在心肌肥大模型中，miRNA-1和miRNA-133可以調(diào)節(jié)異常的表現(xiàn)，另外也可調(diào)控心肌細(xì)胞的凋亡[6]。因此，通過(guò)miRNA在心肌纖維化領(lǐng)域的機(jī)理或許能為臨床治療新的目標(biāo)靶點(diǎn)。mRNA調(diào)控的復(fù)雜性，目前對(duì)miRNA的研究還處于探索階段，因此，本研究希望發(fā)現(xiàn)更多與心肌纖維化相關(guān)的miRNA。

1 實(shí)驗(yàn)方法

選取40只雄性C57BL/6小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字原則進(jìn)行分組：對(duì)照組10只、DM組30只。DM組腹腔注射STZ(40mg/kg/D)5d做T2DM建模，對(duì)照組不做特殊處理。處死小鼠后，取兩組小鼠部分心肌組織用于制作組織切片，放入4%多聚甲醛中，并采用Masson、HE染色處理。采用酒精脫水處理后，制作為蠟片，所有蠟片為4μm薄片，并經(jīng)40℃熱水進(jìn)行預(yù)熱并做燙平處理，然后放入45℃恒溫箱子中晾干后，保存于4℃環(huán)境。

1.1 HE染色

切片進(jìn)行烘烤處理，烘烤溫度60℃，時(shí)間為1h，依次放入二甲苯I、二甲苯Ⅱ、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和70%乙醇，最后用蒸餾水沖洗。依次采用蘇木素、伊紅染液作染色處理，脫水后采用中性樹脂進(jìn)行封片處理，并經(jīng)光鏡查看，及時(shí)拍照記錄。

1.2 Masson 染色

將切片于60℃烘烤1h，脫蠟至水。用鐵蘇木素、藍(lán)化液、麗春紅染液和苯胺藍(lán)依次染色，脫水后用中性樹脂封片，再用光鏡觀察并拍照記錄。

1.3 Western-blot

完成組織總蛋白的提取，取少量心臟末端，放入先配制的組合分解液，研磨30s后，將EP管置于冰上0.5h，于4℃環(huán)境下作離心處理，離心時(shí)間為10min，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，保存在-80℃環(huán)境下，再計(jì)算吸光度值、檢測(cè)蛋白濃度。調(diào)配濃縮膠與分離膠，制備好的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳。樣品兩端分別放入5μL蛋白標(biāo)記物，保留30min后，待Marker完全分開且目的蛋白跑到合適位置后，結(jié)束電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，再封閉1h。一抗孵育和二抗孵育結(jié)束后，在顯影液中將膜浸泡1 min進(jìn)行顯影，并用軟件分析灰度值。

1.4 RNA提取

將心臟末端分別加上1mL Trizol，研磨30s后，轉(zhuǎn)移到1.5mL EP內(nèi)，在冰上分解10min，分別加上200μL的氯仿15s劇烈晃動(dòng)，變成乳濁液，用12000rpm，離心5min，離心環(huán)境44℃，按照1∶1比例加入等量上清異丙醇，按照12000 rpm速度、離心10min，放入適量DEPC水溶解進(jìn)行沉淀，檢測(cè)濃度、純度，設(shè)置空白對(duì)照組DEPC水，純度標(biāo)準(zhǔn)為A260/A280時(shí)為1.8～2.0時(shí)。

1.5 RNA逆轉(zhuǎn)錄

去除DNA：

試劑組分體積(μL)4 × gDNA wiper Mix4primer1模板RNATotal RNA:1pg-1μgRNase free dd H2Oto 16

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：

試劑組分體積(μL)5x HiScript II qRT SuperMix II4第一步反應(yīng)液16

引物序列：

引物名稱序列(5’-3’)miRNA-138-5p RTCTCGCCAGTCTCCCGAGCGGCGCCCTACACTGGATACGACCGGTTCGCCTU6 RTCCCCCACCACACTGAATCTCTGCC

PCR擴(kuò)增：

試劑組分體積(μL)2×SYBR10模板c DNA(稀釋2倍)2Forward primer1Reverse primer1RNase free ddH2O6

目的基因引物序列：

GenesForward primerReverse primermi RNA-138-5P5’-GAGGCTAGCTGGCCCGTTTC-3’5’-TGGCCAAGGTCATCCATGACA-3’U65’-AGCTCACTGGCATGGCCTTCGCG-3’5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’CollagenⅠ5’-GGACCTCATGGCCCACATGG-3’5’-TACAGGTTGAAGAGCTTCTGGC-3’CollagenⅢ5’-GGAAGAGAGAGACCCTCACT-3’5’-CGACAGCTGACTTGCTGAGA-3’Endoglin5’-GGACCTCATGGCCCACATGG-3’5’-TCATCCATGACAACTTTGGT-3’GAPDH5’-AGGAAGAGAGAGACCCTCATGC-3’5’-GACTGTGGATGGCCCTGCTC-3’

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果觀察顯示，紅色為正常心肌細(xì)胞，期間可見(jiàn)散裝分布的膠原纖維，呈藍(lán)色。在對(duì)照組中可見(jiàn)完整良好的心肌結(jié)構(gòu)，緊密且規(guī)律，形態(tài)完好；相比之下，DM組可見(jiàn)病理性特征，細(xì)胞排練紊亂，間質(zhì)疏松，可觀察到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維細(xì)胞增生。正常對(duì)照組心肌組織膠原纖維少，分布均勻，見(jiàn)圖1 。

圖1 HE染色及Masson染色分析小鼠心肌組織病理變化

免疫組化結(jié)果顯示，DM組小鼠心肌組織中CollagenⅠ、CollagenⅢ及Endoglin蛋白可見(jiàn)異常表達(dá)，分別升高了0.63倍、1.06倍和1.16倍，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)圖2 A和B；相比于對(duì)照組，DM組中CollagenⅠ、Collagen Ⅲ及Endoglin的mRNA表達(dá)異常，水平分別為CON組的1.36倍、0.79倍和1倍，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；DM組miRNA-138-5p的水平較CON組下降了68.7%，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，見(jiàn)圖2C和D。

圖2 免疫組化結(jié)果分析

3 討論

根據(jù)流行病調(diào)查，糖尿病發(fā)病率逐年升高，隨著病情惡化發(fā)展，糖尿病患者并發(fā)癥發(fā)生率增加，其中一個(gè)常見(jiàn)的并發(fā)癥為心肌纖維化，會(huì)加重患者致死率[7]，表現(xiàn)為大量心肌成纖維細(xì)胞。心肌纖維化的發(fā)病機(jī)制可理解為：在TGF-1/Smads信號(hào)路徑上，首先TGF 1與T受體RⅡ結(jié)合形成二聚體，激活T受體RI被激活，與TGF-1結(jié)合，作用于Smads蛋白的C端，也就是絲氨酸殘基。當(dāng)激活磷酸化后，Smad2/3以及Smad4被激活形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物[8～10]。內(nèi)分泌素(Endoglin，CD105)主要處于內(nèi)皮細(xì)胞[11]，為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族TGF-的Ⅲ型輔助受體[12]。該激素為TGF-的輔助受體，通過(guò)作用于TGF下游的調(diào)控途徑，參與膠原I的合成，從而促進(jìn)心肌纖維化[13]。內(nèi)分泌素通過(guò)心肌成纖維細(xì)胞中的TGF-I受體，同時(shí)產(chǎn)生激活和抑制Smad1&5的雙重作用，平衡TGF信號(hào)通路平衡[14]。我們推測(cè)并驗(yàn)證Endoglin可能會(huì)作為必要信號(hào)因子抑制TGF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而這一過(guò)程是選擇性的，在Human-CFs(人心肌成纖維細(xì)胞)TGF-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中抑制膠原蛋白合成，從而減輕心肌纖維化[15]。

近年來(lái)，miRNA-138-5p的研究主要集中在口腔癌，胰腺癌、肺癌等癌癥研究領(lǐng)域[16～18]，但罕見(jiàn)于心肌纖維的報(bào)道。研究顯示一個(gè)microRNA可以有多個(gè)靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)基因也可以受到多個(gè)microRNA的生物學(xué)調(diào)控。因此，Endoglin可能是miRNA-138-5p的調(diào)控靶點(diǎn)，并影響心肌纖維化。