韋碧薇，龔雅慧，蘇 州，楊慧瑩，覃蒙斌，梁志海*

(1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530021； 2.荊州市中心醫(yī)院 兒科， 湖北 荊州 434020；3.廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科， 廣西 南寧 530007)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是臨床常見的急腹癥，其發(fā)病機制有多種，胰腺導管上皮屏障的完整性被破壞是AP發(fā)生的主要啟動因素之一[1]。腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是腫瘤壞死因子受體相關蛋白家族的成員，上調(diào)TRAF6可使核因子κB(NF-κB)亞基從細胞質(zhì)進入細胞核，促進促炎因子成熟產(chǎn)生炎性反應，誘發(fā)重癥急性胰腺炎(sever acute pancreatitis，SAP)[2]。有研究表明，NF-κB信號通路激活可以導致胰腺導管上皮屏障損傷[3]。因此，TRAF6可能是NF-κB信號通路上損害胰腺導管上皮屏障的關鍵環(huán)節(jié)，對TRAF6進行調(diào)控也許可以影響胰腺導管上皮屏障損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-125b可以通過多種途徑調(diào)控炎性反應，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[4]。使用Targetscan檢索發(fā)現(xiàn)miR-125b與TRAF6的3′ UTR端位于1 276～1 283的堿基位點上有互補堿基序列。但目前有關miR-125b在TRAF6參與胰腺導管上皮屏障損傷的作用尚不清楚。故本研究擬探討TRAF6調(diào)控胰腺導管上皮屏障的機制、miR-125b與TRAF6靶向結(jié)合關系，以期為AP的發(fā)病機制研究提供新觀點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人胰腺導管上皮細胞系HPDE6C7(廣州吉妮歐生物公司)。

1.1.2 試劑及試劑盒:RPMI-1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(上海吉泰依科賽生物科技有限公司)；Polybrenne及enhanced infection solution(上海吉凱基因科技有限公司)；慢病毒載體和陰性病毒液(南寧維爾凱生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄和擴增試劑盒(TaKaRa公司)；兔抗TRAF6抗體和山羊抗兔二抗(Abcam公司)；兔抗-occludin、-claudin-1、-NF-κB p65、-TAK1及TAB1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；Western blot實驗相關試劑(北京索萊寶科技有限公司)；FITC-D(Sigma-Aldrich公司)；雙熒光素酶報告基因載體和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理： 復蘇后的HPDE6C7細胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h更換次培養(yǎng)基，待細胞匯合至80%時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。將HPDE6C7細胞分為：對照(control)組、TRAF6高表達感染(TRAF6)組和空載慢病毒感染(blank)組。感染6 h后進行換液，TRAF6組換用DEME培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后收集細胞。

1.2.2 RT-qPCR檢測細胞中TRAF6的mRNA表達： 收集處于對數(shù)期生長的細胞，用Trizol法提取各組細胞總RNA，并測定其濃度和純度。RNA反轉(zhuǎn)錄按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，獲得cDNA，再行PCR(SYBRGree染料法)擴增。TRAF6的上游引物序列為5′-CGCGCATAGAACGACAAG-3′，下游引物序列為5′-TTTCCAGGGGTGGGTCAAAC-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CAAATTCCATGGCACCGTCA-3′，下游引物序列為5′-GACTCCACGACGTACTCAGC-3′。反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個樣本設置3個復孔，取平均值，采用2-ΔΔCt的方法計算相對表達水平。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達： 收集各組細胞，加入細胞裂解液提取細胞總蛋白，應用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。進行SDS-PAGE后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜完成置于5%脫脂牛奶中封閉45 min，放入一抗中4 ℃孵育過夜，次日室溫孵育二抗1 h。使用Odyssey系統(tǒng)對條帶進行掃描和分析。

1.2.4 檢測各組細胞的單層細胞通透率： 取各組處于對數(shù)增殖期的細胞，消化后將細胞調(diào)整至3×105個/mL，分別取100 μL加入Transwell小室上室中進行培養(yǎng)。4 d后，用PBS潤洗小室3次，加入適量PBS浸泡小室，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min，充分清洗細胞表面雜質(zhì)。吸凈PBS，于上室加入異硫氰酸熒光素-葡聚糖(fluoresceine isothiocyanate-dextran, FITC-D)，下室加入PBS，室溫孵育1 h。將Transwell小室下室中的PBS溶液轉(zhuǎn)移至96孔板，熒光分光光度計測定各孔熒光強度。相對通透率(%)=(實驗孔熒光值-空白孔熒光值)/(對照孔熒光值-空白孔熒光值)×100%。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-125b與TRAF6的靶向結(jié)合關系： 利用Targetscan預測TRAF6基因3′UTR區(qū)第1276-1283號堿基與has-miR-125b-5p存在結(jié)合位點。合成包含TRAF6基因3′UTR與has-miR-125b-5p結(jié)合位點的野生型(wild-type，WT)序列和突變(mutant，mut)序列，長度均為209 bp。構(gòu)建TRAF6-WT質(zhì)粒和TRAF6-mut質(zhì)粒，利用Lipofectamin 3000將雙熒光素酶質(zhì)粒和miR-125b模擬物mimics共同轉(zhuǎn)染293T細胞并分別設立對照，4個組分別為TRAF6-WT+mimic control組、TRAF6-WT+miR-125b mimic組、TRAF6-mut+mimic control組和TRAF6-mut+miR-125b mimic組；轉(zhuǎn)染48 h后，計算相對發(fā)光強度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 TRAF6轉(zhuǎn)染HPDE6C7細胞的效果

感染HPDE6C7細胞TRAF6基因后，TRAF6組中TRAF6基因表達水平明顯高于對照組和blank組(P<0.05)(圖1)。

2.2 上調(diào)TRAF6對HPDE6C7細胞相關因子的影響

與對照組相比，TRAF6組的NF-κB p65、TAK1和TAB1蛋白表達升高(P<0.05)。相反，occludin和claudin-1蛋白顯著降低(P<0.05)(圖2)。

2.3 單層HPDE6C7細胞FITC-D通透率的測定

上調(diào)TRAF6基因后，TRAF6組單層細胞通透率明顯高于對照組(P<0.05)(圖3)。

2.4 miR-125b與TRAF6的靶向結(jié)合關系的驗證

TRAF6-WT+miR-125b mimic組與TRAF6-WT+mimic control組比，熒光強度顯著下降(P<0.05)(圖4)。

3 討論

AP是常見的胰腺炎性疾病，以炎性細胞浸潤和胰腺壞死為特征。當進展為SAP，可出現(xiàn)全身炎性反應綜合征、多器官功能衰竭等多種嚴重并發(fā)癥[5]。胰腺導管上皮屏障是由胰管上皮細胞及其分泌黏液組成，其在生理狀態(tài)下防止膽汁、胰蛋白酶等反流進入胰腺實質(zhì)，同時防止胰液中HCO3-反流入血液[1]。胰腺相鄰細胞間連接有緊密連接(tight junction，TJ)、橋粒、黏附連接和縫隙連接等， 胰管上皮細胞間的TJ是維持胰腺導管上皮屏障完整性的主要連接方式，能防止炎性介質(zhì)侵入胰腺組織[6]。TRAF6是一種泛素連接酶，可介導急慢性炎性疾病的發(fā)生。被上游信號激活后，TRAF6與泛素偶聯(lián)酶復合物一起作用，激活包括TAB1在內(nèi)的TAK1復合物，進而磷酸化和激活IκB激酶，啟動NF-κB入核，最后產(chǎn)生炎性反應[7-8]。細胞間通透性是上皮屏障功能的重要組成部分，利用Transwell小室可檢測細胞間通透性[9]。有研究發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外實驗中，激活NF-κB信號通路可以增加細胞間通透性并損傷上皮屏障功能[10-11]。本課題組前期研究已經(jīng)證實激活NF-κB信號通路可促使胰腺導管上皮細胞間TJ減弱，胰管上皮屏障損傷以及通透性增加[12]。因此，本研究旨在探討TRAF6能否作為關鍵蛋白通過激活NF-κB信號通路引起AP發(fā)病的胰腺導管上皮屏障受損。

A.mRNA expression of TRAF6; B,C.protein expression of TRAF6; *P<0.05 compared with control and blank group圖1 各組HPDE6C7細胞TRAF6的表達量Fig 1 Expressions levels of TRAF6 in HPDE6C7 n=3)

*P<0.05 compared with control group圖2 Western blot檢測各組細胞NF-κB p65、TAK1、TAB1、occludin和claudin-1蛋白表達

*P<0.05 compared with control group圖3 各組單層HPDE6C7細胞的相對通透率Fig 3 Relative permeability in monolayer HPDE6C7

*P<0.05 compared with TRAF6-WT+mimic control group圖4 miR-125b與TRAF6基因的靶向關系Fig 4 Targeted binding of miR-125b and TRAF6

miRNAs是一類內(nèi)源基因編碼的長度約22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其發(fā)揮作用的方式主要是通過與目標mRNA分子的 3′端非編碼區(qū)域(3′-untranslated region，3′-UTR)序列互補結(jié)合，引起靶基因 mRNA 的降解或抑制翻譯，介導轉(zhuǎn)錄后基因沉默。另外，近年來研究發(fā)現(xiàn) miRNA 還可以與受體直接互作，產(chǎn)生對信號傳導通路的影響[13]。有研究表明，miR-125b可降低TRAF6表達，抑制NF-κB活化，減輕炎性反應[14-15]。所以miR-125b可能與TRAF6特異性結(jié)合影響上述機制。

本研究選取人胰腺導管上皮細胞HPDE6C7作為研究對象，研究發(fā)現(xiàn)TRAF6基因過表達能顯著上調(diào)HPDE6C7細胞NF-κB p65、TAK1和TAB1蛋白水平，并且使緊密連接蛋白occludin和claudin-1表達下降，上調(diào)TRAF6同時可增加HPDE6C7細胞的單層細胞通透率。另外，雙熒光素酶報告基因表明miR-125b可與TRAF6的3′ UTR mRNA靶向結(jié)合，抑制熒光素酶表達。

綜上所述，HPDE6C7細胞中高表達TRAF6可能激活NF-κB信號通路，改變胰腺導管上皮細胞緊密連接蛋白表達、影響胰腺導管上皮屏障的通透性。同時，miR-125b可能通過與TRAF6靶向結(jié)合抑制該機制。進一步研究miR-125b調(diào)控TRAF6在HPDE6C7細胞的作用機制，有利于闡明AP發(fā)病機制，也可為AP的治療提供新的靶點和基礎實驗依據(jù)。