許洋 王智 孫羽婕 田偉 馮德建 周黎黎

摘要：建立離子色譜法測定綠茶中亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量的方法，茶樣前處理方式模擬日常飲茶方式制備茶葉浸提液，依次經(jīng)過 C18柱、Ag 柱和 Na柱凈化，直接進樣，采用 KOH 梯度洗脫。亞硝酸鹽和硝酸鹽工作曲線呈良好的線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.9999和0.9992;添加三個濃度水平的加標回收率在96.3%～106.0%之間，精密度測試的相對標準偏差（RSD）值均小于5%。采用該方法對市售46個茶葉進行亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測，結(jié)果顯示各地所采集的綠茶中亞硝酸鹽均存在未檢出的情況，檢出率和檢出含量低。但幾乎所有的樣品中硝酸鹽均檢出，且有27.8%茶葉樣品硝酸鹽含量逼近甚至超過250 mg/kg。

關(guān)鍵詞：茶葉;亞硝酸鹽;硝酸鹽;風險

中圖分類號： TS272.7;S571.1文獻標志碼： A文章編號：1674–5124（2021）12–0058–06

Determination of nitrite and nitrate in green tea and exploration of health risk

XU Yang，WANG Zhi，SUN Yujie，TIAN Wei，F(xiàn)ENG Dejian，ZHOU Lili

（Standard and Testing Technology of Tea Key Laboratory of Sichuan Province， National Institute ofMearsurement and Testing Technology， Chengdu 610021， China）

Abstract： An ion chromatography method was established to determine the content of nitrite and nitrate in green tea. In the pretreatment of tea samples， tea extracts were prepared by simulating the way of daily tea drinking. After purification on C18 column， Ag column and Na column， samples were directly injected and then eluted by KOH gradient. There was a good linear correlation between nitrite and nitrate working curves， andthecorrelationcoefficientwas 0.9999 and 0.9992，respectively. Therecoveryratesofthethree concentrations ranged from 96.3% to 106.0%， and the relative standard deviations （RSD） of the precision tests were all lower than 5%. The method was used to detect the nitrite and nitrate in 46 tea leaves sold in the market. The results showed that the nitrite in green tea collected from different places had not been detected， and the detection rate and detection content were low. However， almost all nitrates were detected， and the nitrate content in 27.8% of the samples approached or even exceeded 250 mg/kg.

Keywords： tea; nitrite; nitrate; risk

0引言

全世界有30億人飲茶，茶葉的質(zhì)量安全問題至關(guān)重要。醫(yī)學研究證明攝入過多的硝酸鹽，會對人體健康產(chǎn)生危害[1]，硝酸鹽在體內(nèi)還會轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，會增加患消化系統(tǒng)癌癥的幾率[2-3]。全球各國采取了一系列相關(guān)措施控制食品中亞硝酸鹽的含量以及水質(zhì)中硝酸鹽的含量，但卻遲遲未給出茶葉和茶飲料相應(yīng)的限量。有研究表明，茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量不足以達到人體的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）值[4]。但并不意味著我們可以對此安枕無憂，隨著茶葉生產(chǎn)中氮肥施用量越來越大[5]，越來越多的茶葉制品（如抹茶、茶粉等）添加在食品中，勢必需要制定更高更嚴苛的質(zhì)量安全標準來進一步嚴格把控茶葉質(zhì)量安全。

目前，有關(guān)茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽檢測方法主要有分光光度法[6-9]和離子色譜法[10-23]。離子色譜法能簡便、快速、準確地同時檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽。

本文擬建立茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的離子色譜快速檢測方法，并利用此方法分析綠茶中硝酸鹽和亞硝酸鹽污染現(xiàn)狀，避免茶葉質(zhì)量安全問題的盲區(qū)，對茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽健康風險進行初步評估，希望能為監(jiān)管部門制定茶葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽限量標準以及采取相關(guān)預(yù)防控制措施提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

材料：ProElut C18固相萃取柱（500 mg/6 mL）。

標準品：亞硝酸根離子溶液標準物質(zhì) GBW（E）082643;硝酸根離子溶液標準物質(zhì) GBW（E）082049;試驗采用具有標準物質(zhì)證書的亞硝酸鹽和硝酸鹽標準溶液或采用基準試劑進行標準儲備液制備。

亞硝酸鹽標準儲備液：準確稱取亞硝酸鈉0.1500 g，于110～120℃干燥至恒重，用超純水溶解并定容至1000 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的亞硝酸鹽標準儲備液，于4℃下保存，有效期為兩個月。使用時根據(jù)需要稀釋成適當質(zhì)量濃度的系列標準工作溶液。

硝酸鹽標準儲備液：準確稱取硝酸鈉1.3710 g，于110～120℃干燥至恒重，用超純水溶解并定容至1000 mL，配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L 的硝酸鹽標準儲備液，于4℃下保存，有效期為兩個月。使用時根據(jù)需要稀釋成適當質(zhì)量濃度的系列標準工作溶液。

1.2儀器

ICS-2100型離子色譜儀，超聲波清洗器， Sartorius BP 211D 型電子天平，Millipore Milli-Q 型超純水器，0.22?m水性濾膜針頭濾器，C18柱、Ag 柱和 Na 柱。

1.3測定方法

1.3.1樣品前處理

茶葉樣品烘干粉碎待測，準確稱取約2.0000 g ????? （精確到0.0001 g ）茶葉樣品于250 mL 具塞三角瓶中，加入100 mL 新煮沸的超純水沖泡茶樣，搖勻，超聲提取30 min，放置5 min 后抽濾，冷卻至室溫，取15 mL 浸提液過活化過的 C18固相萃取柱，棄去前面3 mL，收集后面流出液待測（若氯離子濃度高于50 mg/L，建議在通過 C18柱后，再通過 Ag 柱和 Na 柱，棄去前面7 mL），最后通過0.22?m水性濾膜針頭濾器，供離子色譜儀測定。固相萃取柱使用前按廠家要求進行活化。

1.3.2離子色譜條件

色譜柱：IonPac AS15（4 mm×250 mm ）;流動相： KOH 溶液（免化學試劑）外加水模式;流量：

1.5 mL/min;色譜柱溫度：30℃;進樣量：50?L。

2結(jié)果與討論

2.1樣品前處理條件的優(yōu)化

本實驗前處理方式模擬日常飲茶習慣來制備茶葉浸提液，以便了解在日常飲茶方式下攝取到的亞硝酸鹽和硝酸鹽的含量，對健康飲茶起到指導(dǎo)作用。由于亞硝酸鹽和硝酸鹽極易溶于水，選擇用沸水進行沖泡提取，隨后再用超聲提取30 min，讓固相充分提取混勻。實驗結(jié)果表明，亞硝酸鹽和硝酸鹽的提取很充分，但由于茶葉的成分十分復(fù)雜，同時提取出了較多色素、茶多酚、咖啡堿、有機酸等有機成分，需要再引入凈化步驟以減少基質(zhì)干擾。

實驗考察了 C18固相萃取柱和活性炭柱對亞硝酸鹽和硝酸鹽的吸附效果，結(jié)果表明，兩種固相萃取柱對亞硝酸鹽和硝酸鹽均沒有保留，回收率均良好，但由于亞硝酸鹽的出峰時間與氯離子接近，會對亞硝酸鹽檢測造成影響，而茶葉中亞硝鹽酸即便有，含量也很微量，因此為了降低亞硝酸鹽的檢出限，當樣品中氯離子含量過高時，建議再通過 Ag 柱和 Na 柱去除氯離子的影響。以便更微量的亞硝酸鹽能被檢出。

2.2色譜條件的優(yōu)化

亞硝酸鹽和硝酸鹽在常規(guī)的陰離子色譜柱上都有很好的保留，但由于茶葉浸提液中小分子的有機酸十分多，且出峰時間很集中，某些小分子有機酸如奎尼酸、乙酸、甲酸等與無機酸會造成與亞硝酸鹽的共洗脫[9]，對亞硝酸鹽的檢測結(jié)果造成很大的干擾。

實驗考察了IonPac AS11-HC （4 mm×250 mm ）和IonPac AS15（4 mm×250 mm ）兩種色譜柱對亞硝酸鹽和硝酸鹽分離效果的影響，結(jié)果表明，IonPac AS15（4 mm×250 mm ）色譜柱由于其疏水性好，因此小分子有機酸與無機離子的分離度比IonPac AS11-HC 效果更好一些，且回收率也較好，因而選擇IonPac AS15（4 mm×250 mm ）作為分析色譜柱。

實驗還考察了流動相 KOH 溶液濃度對亞硝酸鹽和硝酸鹽分離效果的影響，結(jié)果表明，當 KOH 溶液濃度為20 mmol 時，亞硝酸鹽色譜峰附近的干擾很多，呈現(xiàn)堆積出峰的現(xiàn)象，無法達到完全分離，見圖1、圖2。隨著 KOH 濃度的降低，亞硝酸鹽與相鄰色譜峰之間的分離度逐漸變好，當梯度洗脫起始濃度降為1.0 mmol 時，干擾的小分子有機酸才能夠逐一出峰，分離效果最佳，且色譜峰尖銳對稱，見圖3，圖4。綜合考慮保留時間、流速、分析時間的因素，最終確定了最優(yōu)的色譜條件見表1。

2.3方法學驗證結(jié)果

實驗分別進行了方法的線性范圍、靈敏度、回收率和精密度考察。

2.3.1方法的線性范圍、靈敏度考察

表2結(jié)果表明，本測試方法的工作曲線在線性范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)，并且亞硝酸鹽和硝酸鹽的色譜峰與相鄰色譜峰能夠達到基線分離;將系列濃度的對照品標準溶液按照質(zhì)量濃度由低至高依次注入離子色譜儀分析，采用信噪比法測定亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測限與定量限。信噪比（ signal- noise ratio，S/N）在3左右時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢測限濃度，信噪比（S/N）在10左右時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為定量限濃度，測試結(jié)果見表3、表4，亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢出限分別為0.2 mg/kg 和0.4 mg/kg，定量限分別為0.75 mg/kg 和2.0 mg/kg ，能夠很好地滿足茶葉樣品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測和監(jiān)管需要，該方法的靈敏度較好。

2.3.2方法的回收率和精密度考察

選取1種綠茶樣品進行加標回收試驗，稱取樣品12份，分成4組，每組3份，其中1組作為空白樣品，另外3組分別添加1.6 mg/kg、2.0 mg/kg、2.4 mg/kg 3個不同質(zhì)量濃度的亞硝酸鹽標準溶液，同時添加200 mg/kg、250 mg/kg、300 mg/kg 3個不同質(zhì)量濃度的硝酸鹽標準溶液，每個樣品按照本方法進行測定，計算方法的回收率，結(jié)果見表5。由表5可知，本方法測定亞硝酸鹽的回收率為100.8%～104.2%之間，硝酸鹽的回收率為96.3%～106.0%之間，測定結(jié)果的相對標準偏差（ rlativesandard deviation，RSD）值均小于7%，說明此方法具有良好的準確度。

選取同一份茶葉樣品按照本方法制備供試品溶液，平行制備6份，考察精密度，結(jié)果見表6，亞硝酸鹽和硝酸鹽的測定結(jié)果的相對標準偏差 RSD 值均小于5%，表明該方法的精密度好。

2.4健康風險評估

采用本文驗證的方法對全國市售46個綠茶中亞硝酸鹽和硝酸鹽進行檢測，最終結(jié)果見表7，在46個綠茶樣品中，亞硝酸鹽整體檢出率很低，最高為11.1%，為個別茶樣，檢出含量范圍為未檢出（notdetected，ND ）～2.1 mg/kg，各地所采集的綠茶均存在未檢出的情況，目前看來不存在食用風險問題。硝酸鹽檢出率為100%，含量范圍為62.01～295.48 mg/kg，硝酸鹽含量隨綠茶嫩度的降低而升高。目前對于茶葉中亞硝酸鹽和硝酸鹽均沒有限量要求，但茶作為受歡迎的飲料，愛飲茶之人每日攝入，可參照國內(nèi)外飲用水的限量標準進行健康風險的初步探索，目前各國飲用水的硝酸鹽限量普遍為10 mg/L，歐盟最低，為5 mg/L，茶湯若按歐盟對于飲用水中硝酸鹽的限量進行折算，則茶葉中硝酸鹽含量不高于250 mg/kg 為安全，愛喝濃茶者則對應(yīng)的安全值還要降低。從本實驗結(jié)果來看，盡管大部分茶樣硝酸鹽含量在此安全范圍內(nèi)，但仍然有27.8%樣品硝酸鹽含量逼近甚至超過250 mg/kg，存在健康風險。

3結(jié)束語

本文建立了采用離子色譜法測定茶湯中亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測方法，前處理簡單，符合日常飲茶方式，測定結(jié)果準確可靠，本實驗方法不僅可消除小分子有機酸、色素帶來的干擾問題，檢出限低，可用于建立標準方法，而且可直觀地了解飲茶時真實攝入的亞硝酸鹽和硝酸鹽含量，幫助進一步制定合理的限量標準。

本實驗通過參考飲用水限量對綠茶進行了健康風險的初步探索，部分綠茶硝酸鹽存在健康風險，盡管本實驗綠茶樣本來源較廣較隨機，且飲茶的習慣和方式各國各地、甚至個人喜好都不同，但可以為茶葉健康風險作出初步的提示，應(yīng)逐步引起居民和監(jiān)管部門的關(guān)注，全面和深入地開展污染現(xiàn)狀研究和健康風險評估，確定有效的檢測手段和制定合理的限量標準，推動我國茶產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

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（編輯：莫婕）