宋立曉 侯忠樂 任一鳴 嚴(yán)繼勇 曾愛松 許園園 張昌偉

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)是作物分子設(shè)計(jì)育種的重要手段，sgRNA設(shè)計(jì)對于提高基因編輯效率具有重要作用。為了提高sgRNA設(shè)計(jì)的準(zhǔn)確度，構(gòu)建了聚乙烯亞胺修飾的單壁碳納米管（PEI-SWNT）介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系，并用于檢測青花菜CRISPR/Cas9基因編輯效率。結(jié)果表明，CRISPR/Cas9編輯體系可以誘導(dǎo)青花菜特定基因位點(diǎn)發(fā)生突變，編輯效率為8.3%。研究結(jié)果為利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)創(chuàng)制青花菜新種質(zhì)提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青花菜;基因編輯;單壁碳納米管;瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

中圖分類號：S635.301 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2021）13-0056-03

青花菜（Brassica oleracea L .var. italica Planch）又名西蘭花，是十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種中以綠色花球?yàn)楫a(chǎn)品的一、二年生草本植物。營養(yǎng)價(jià)值較高，含有豐富的維生素，并含抗癌物質(zhì)，受到消費(fèi)者的青睞。青花菜栽培歷史較短，但發(fā)展很快，在我國已成為一些地區(qū)出口創(chuàng)匯的重要優(yōu)質(zhì)蔬菜種類之一。通過現(xiàn)代育種技術(shù)，提高青花菜種質(zhì)資源的抗性和品質(zhì)，對于青花菜品種選育工作非常重要。

近年來CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)作為一種新型生物學(xué)研究手段被開發(fā)利用，該系統(tǒng)憑借其技術(shù)優(yōu)越性被廣泛應(yīng)用于擬南芥、煙草、玉米等多種作物的基因組定點(diǎn)編輯[1-3]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率受多種因素影響，Cas9核酸酶啟動(dòng)子、sgRNA啟動(dòng)子的類型、sgRNA與目標(biāo)位點(diǎn)的結(jié)合效率，目標(biāo)靶點(diǎn)的數(shù)目、載體的類型、轉(zhuǎn)化的方式以及宿主植株的同源重組修復(fù)能力等;優(yōu)化Cas9基因的密碼子可以提高編輯效率[4-5]。熊興鵬對甘藍(lán)型油菜的研究結(jié)果表明，利用不同的sgRNA，其編輯效率從20%到56%不等[6-7]。

不同的sgRNA序列對于目標(biāo)基因的結(jié)合效率具有很大的差異，在依靠特定軟件對sgRNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)時(shí)，各個(gè)軟件會依據(jù)sgRNA序列的堿基種類對其編輯效率進(jìn)行估算，不同軟件的算法差異以及作物種類的影響會造成估算結(jié)果常與實(shí)際的編輯效率有較大的差異[8]，為了排除干擾因素的影響，通過瞬時(shí)表達(dá)對CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化載體的編輯效率進(jìn)行檢測就尤為重要。

青花菜的再生體系建立比較困難，轉(zhuǎn)化的效率也較低，在實(shí)際的操作中往往是經(jīng)過復(fù)雜的步驟實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化卻由于基因編輯載體的效率較低而無法實(shí)現(xiàn)基因編輯，為了避免這種情況，有必要在遺傳轉(zhuǎn)化前對基因編輯載體的編輯效率進(jìn)行檢測。

近年來納米材料漸漸應(yīng)用到植物的遺傳轉(zhuǎn)化中[9]。碳納米管和聚乙烯亞胺復(fù)合體介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是利用聚乙烯亞胺帶正電的特性吸附帶負(fù)電的質(zhì)粒載體，利用碳納米管長徑比很大的特性，刺破植物細(xì)胞壁，將外源載體導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)[10]。利用聚乙烯亞胺修飾的碳納米管介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化在煙草、小麥、棉花上都已成功實(shí)現(xiàn)，在青花菜上還未有先例，本研究參照煙草試驗(yàn)方法，探索該體系在檢測青花菜基因編輯效率上應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用青花菜品種是蘇青3號，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育而成，由筆者所在課題組保存;碳納米管購自于先豐納米材料科技有限公司，聚乙烯亞胺購自于Sigma-Aldrich。相關(guān)試驗(yàn)于2019年10—12月在江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 sgRNA的設(shè)計(jì)與基因編輯載體的構(gòu)建

用CRISPR-p2.0（http：//crispr.hzau.edu.cn）在線軟件對青花菜紫色相關(guān)基因BEE1（Bol030777）基因序列進(jìn)行靶位點(diǎn)分析，選擇位于外顯子上、GC含量不低于50%、靠近基因編碼區(qū)5'端的序列作為靶位點(diǎn)[11];將候選的sgRNA與青花菜的基因組序列進(jìn)行比對，淘汰脫靶率較高的sgRNA，設(shè)計(jì)的sgRNA序列如表1所示，并將人工合成的sgRNA序列連接到北京唯尚立德公司VK005-14質(zhì)粒載體上[12]。選擇測序結(jié)果一致的質(zhì)粒進(jìn)行搖菌擴(kuò)繁，質(zhì)粒提取步驟按照天根生化科技（北京）有限公司質(zhì)粒提取試劑盒說明書進(jìn)行，提取的質(zhì)粒濃度需達(dá)到1 000 ng/μL，濃度不夠則利用濃縮儀進(jìn)行濃縮。

1.3 PEI-SWNT的制備

按照文獻(xiàn)[13-14]的方法制備PEI-SWNT。將1.3 mg干燥COOH-SWNTs加入50 mL錐形底離心管中，加入30 mL蒸餾水，超聲波浴處理獲得COOH-SWNT懸濁液，PEI與COOH-SWNTs共反應(yīng)獲得PEI-SWNT復(fù)合體。PEI與COOH-SWNTs按照1 ∶ 20的比例共反應(yīng)獲得PEI-SWNT復(fù)合體，將PEI-SWNT復(fù)合體轉(zhuǎn)移到100000-MWCO過濾器中。用無核酸酶的水洗滌PEI-SWNT溶液6次，將過量的PEI洗去。

1.4 基因編輯載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化青花菜葉片

準(zhǔn)備MES輸送緩沖液（pH值=4.5～5.0）用于稀釋PEI-SWNT，以PEI-SWNT ∶ DNA（3 ∶ 1）的質(zhì)量比將500 ng PEI-SWNTs與167 ng質(zhì)粒DNA復(fù)合在一起，室溫下孵育30 min以形成DNA-PEI-SWNT復(fù)合物。將DNA-PEI-SWNT溶液吸入 1 mL 的無針注射器。在青花菜葉子背面用針尖刺穿，將注射器緩慢注射到青花菜的葉片中。在葉片上輕輕地標(biāo)記入滲區(qū)域，1 d后質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)錄為mRNA，2～3 d將mRNA翻譯為蛋白。

1.5 青花菜子葉中瞬時(shí)表達(dá)熒光蛋白檢測

將注射后的植株轉(zhuǎn)移到光培箱（光周期為白天16 h，27 ℃;夜晚8 h，22 ℃）進(jìn)行培養(yǎng)。于注射后第3天（72 h）在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片是否有GFP熒光蛋白表達(dá)。

1.6 候選sgRNA基因編輯效率檢測

取青花菜葉片有GFP熒光表達(dá)部位的葉片，用CTAB法提取葉片的基因組DNA，根據(jù)編輯的基因序列設(shè)計(jì)包含編輯位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（表2）。純化回收擴(kuò)增后的PCR片段，連接T載體后進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，每個(gè)樣品挑取8個(gè)單克隆搖菌后PCR擴(kuò)增測序。將測序結(jié)果與青花菜的基因序列進(jìn)行比較，檢測基因位點(diǎn)是否被編輯，并計(jì)算編輯效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SWNT水分散液濃度和PEI-SWNT分散液濃度分析

通過對SWNT和PEI-SWNT濃度的測量表明SWNT水懸濁液的濃度為90.11 mg/L（建議濃度在100 mg/L左右），PEI-SWNT的濃度可以達(dá)到41.72 mg/L（表3），回收效率為46.3%。PEI-SWNT的濃度達(dá)到試驗(yàn)要求。

2.2 青花菜葉片GFP熒光表達(dá)分析

利用熒光共聚焦顯微鏡觀察熒光標(biāo)簽的表達(dá)情況，由圖1可見，注射碳納米管和質(zhì)粒的復(fù)合體的青花菜葉片可在共聚焦顯微鏡下觀察到綠色的熒光，說明GFP蛋白在注射后第3天已經(jīng)在葉片表達(dá)，通過此方法可以將外源基因?qū)氲角嗷ú说娜~面細(xì)胞中并完成外源基因的表達(dá)。本試驗(yàn)成功注射32個(gè)葉片中有7個(gè)可以在熒光共聚焦下觀察到綠色熒光，占注射總數(shù)的21.9%。

2.3 青花菜CRISPR/Cas9系統(tǒng)候選sgRNA基因編輯結(jié)果

提取有GFP熒光蛋白表達(dá)的葉片DNA，用表2的引物擴(kuò)增檢測有GFP熒光表達(dá)的青花菜基因組的序列，膠回收PCR產(chǎn)物，然后連接到T載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，將挑取的24個(gè)單克隆樣品搖菌后進(jìn)行測序。測序的結(jié)果中有2個(gè)編號樣品的序列在基因編輯位點(diǎn)附近發(fā)生了基因突變，第5號樣品在B1編輯位點(diǎn)PAM附近檢測到3個(gè)堿基的缺失，第10號樣品檢測到B1編輯位點(diǎn)單堿基的突變（圖2），B2和B3編輯位點(diǎn)沒有檢測到基因突變。sgRNA在青花菜中的編輯效率為8.3%。

3 討論

基因編輯技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各類蔬菜的種質(zhì)資源創(chuàng)新中，sgRNA的編輯效率是影響基因編輯技術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一[15]，通過常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化方法對sgRNA有效性進(jìn)行驗(yàn)證比較耗時(shí)，且成本較高[12]。瞬時(shí)表達(dá)體系作為一種簡便高效的方法可用于快速驗(yàn)證sgRNA的編輯效率，徐璇等利用柑橘的原生質(zhì)體成功實(shí)現(xiàn)了柑橘的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化[16]，鄭天慧等利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法在擬南芥上實(shí)現(xiàn)了基因編輯并篩選出高效率的sgRNA序列。但通過原生質(zhì)體實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的方法存在許多局限性，如試驗(yàn)過程中材料容易被污染，對編輯效率的檢測難度大等。已有研究表明，PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法具有操作簡便、檢測周期短等優(yōu)點(diǎn)，能夠被用于驗(yàn)證sgRNA的編輯效率。本研究探索了在青花菜上建立切實(shí)可行的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法，該方法操作簡便、快速，可以方便快捷地驗(yàn)證sgRNA的編輯效率。

本研究在已有研究的基礎(chǔ)上優(yōu)化了試驗(yàn)步驟，較大幅度提高了碳納米管分散液的濃度，利用PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在青花菜上實(shí)現(xiàn)了更加高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)結(jié)果表明，SWNT水懸濁液的濃度可以達(dá)到90 mg/L以上，PEI-SWNT溶液的濃度可以達(dá)到41.72 mg/L，SWNT結(jié)合PEI后的回收率為46.3%，可以滿足試驗(yàn)的需求;PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系可以將外源載體通過葉面注射的方法導(dǎo)入到青花菜的葉面細(xì)胞中。提取青花菜瞬時(shí)轉(zhuǎn)化部位葉片的基因組DNA，對編輯位點(diǎn)進(jìn)行測序后發(fā)現(xiàn)有單堿基的突變和缺失，說明構(gòu)建的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在青花菜上具有編輯能力。本試驗(yàn)結(jié)果顯示由PEI-SWNT介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系可以完成對青花菜更加高效的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，本方法相較于其他瞬時(shí)轉(zhuǎn)化方法更簡單高效，且單次轉(zhuǎn)化成本可以降低到3美元。該方法為利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制青花菜的新種質(zhì)奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu W，Zhu X，Lei M，et al. A detailed procedure for CRISPR/Cas9-mediated gene editing in Arabidopsis thaliana[J]. Science Bulletin，2015，60（15）：1332-1347.

[2]Liang Z，Zhang K，Chen K，et al. Targeted mutagenesis in Zea mays using TALENs and the CRISPR/Cas system [J]. Journal of Genetics and Genomics，2014，41（2）：63-68.

[3]Gao J，Wang G，Ma S，et al. CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Nicotiana tabacum [J]. Plant Molecular Biology，2015，87（1）：99-110.

[4]張玉苗，李 蓉，魯 瑤，等. 基于提高CRISPR/Cas基因編輯效率的研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2019，40（10）：2006-2015.

[5]時(shí) 歡，林玉玲，賴鐘雄，等. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的植物基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展 [J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2018，24（3）：640-650.

[6]Xiong X，Liu W，Jiang J，et al. Efficient genome editing of Brassica campestris based on the CRISPR/Cas9 system [J]. Mol Genet Genomics，2019，294（5）：1251-1261.

[7]陳 凱. CRISPR技術(shù)的優(yōu)化及Cas9酶PAM識別位點(diǎn)的改造[D]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2017：43.

[8]Zhu Q，Liu Y G，Ma X，et al. A protocol for CRISPR/Cas9-based multi-gene editing and sequence decoding of mutant sites in plants [J]. Scientia Sinica Vitae，2018，48（7）：783-794.

[9]孔倩倩，李志輝，王 瓊，等. 納米基因載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào). 2010，6：6-12.

[10]袁剛強(qiáng). 單壁碳納米管材料（SWCNTs）對水稻的植物毒性效應(yīng)的研究[D]. 湖南大學(xué)，2015：50-51.

[11]王瑋瑋，劉瑞琪，吳勇延，等. CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)研究進(jìn)展及其在動(dòng)物基因編輯研究中的應(yīng)用 [J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào).2019，7：1299-1305.

[12]Demirer G S，Zhang H，Matos J L，et al. High aspect ratio nanomaterials enable delivery of functional genetic material without DNA integration in mature plants [J]. Nat Nanotechnol，2019，14（5）：456-464.

[13]Demirer G S，Zhang H ，Goh N S，et al. Carbon nanotube-mediated DNA delivery without transgene integration in intact plants[J]. Nature Protocol，2019，14（10）：1-24.

[14]丁莉萍，張杰偉，馬 艷，等. CRISPR/Cas基因組編輯技術(shù)研究進(jìn)展及其在植物中的應(yīng)用[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，2019，55（4）：411-424.

[15]馬興亮，劉耀光.植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析[J]. 遺傳，2016，38（2）：118-125.

[16]徐 旋. 柑橘原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及利用CRISPR/Cas9技術(shù)定點(diǎn)突變山金柑基因[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018：43-46.