尹暢

【摘 要】CRISPR/Cas9 是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)。該系統(tǒng)為細(xì)菌與古細(xì)菌中抵御外源病毒和質(zhì)粒DNA入侵的獲得性免疫機(jī)制系統(tǒng)，與TALEN和ZFN 技術(shù)設(shè)計(jì)相比更加簡(jiǎn)單、更容易操作，目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、細(xì)菌、斑馬魚(yú)、豬、小鼠、食蟹猴以及多種植物的基因組精確修飾，是最具有臨床與應(yīng)用前景的基因治療技術(shù)之一。

【關(guān)鍵詞】基因編輯；CRISPR/Cas9系統(tǒng)

早在1987 年，CRISPR序列由日本科學(xué)家在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)[1]，但由于這段序列的功能無(wú)法確定，因此該發(fā)現(xiàn)一直未引起人們的注意，隨后，研究人員研究發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，隨著人們對(duì)該結(jié)構(gòu)的逐漸了解，2002 年，這種結(jié)構(gòu)被正式定義為CRISPR。2005 年，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列可以識(shí)別并結(jié)合特定的噬菌體DNA 序列，從而使得CRISPR序列在獲得性免疫中發(fā)揮作用。2008 年，Marraffini 等[2]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR 系統(tǒng)能夠阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，并首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR 系統(tǒng)的功能，科學(xué)家們也由此揭開(kāi)了研究CRISPR 系統(tǒng)作用機(jī)制的序幕。

1 CRISPR的結(jié)構(gòu)與分類

CRISPR 作為一種特殊DNA 重復(fù)序列，主要由多段長(zhǎng)度為25 50 bp 長(zhǎng)度的高度保守重復(fù)序列和26 72 bp 長(zhǎng)度的間隔序列串聯(lián)而成。同一個(gè)CRISPR位點(diǎn)中的重復(fù)序列一般具有極高的保守性，5端與3端部分尤為保守，但在微生物種間甚至同一個(gè)基因組的不同CRISPR位點(diǎn)間卻存在較大的差異。另外，不同的CRISPR位點(diǎn)，其包含的間隔序列的數(shù)量差別也很大，從幾個(gè)到幾百個(gè)不等。

CRISPR/Cas 系統(tǒng)大體上可以分為3大類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型在介導(dǎo)外源DNA 降解過(guò)程中需要多種Cas 蛋白來(lái)參與反應(yīng)，形成的切割復(fù)合體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，Ⅱ型系統(tǒng)組分則較為簡(jiǎn)單，只需要一個(gè)Cas9 蛋白來(lái)切割DNA 雙鏈。一個(gè)簡(jiǎn)易的Ⅱ型CRISPR/Cas 系統(tǒng)必定要含有g(shù)RNA 和Cas9，Cas9 蛋白具有改造crRNA 和破壞雙鏈DNA 的雙重功能，位于gRNA 5' 端的20 bp左右的堿基決定CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在應(yīng)用時(shí)Cas9核酸酶特異性切割的位點(diǎn)，主要負(fù)責(zé)決定CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的特異性。目前以Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)為基礎(chǔ)的CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在基因組編輯中有較為廣泛的應(yīng)用。

2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理

CRISPR/Cas9 基因組編輯技術(shù)的基本原理為，將tracrRNA： crRNA 設(shè)計(jì)為引導(dǎo)RNA（gRNA），gRNA 包含位于5端靶DNA 的互補(bǔ)序列以及位于3端tracrRNA： crRNA 的類似序列，利用靶DNA 的互補(bǔ)序列來(lái)定位需要編輯的位點(diǎn)，利用該類似序列與Cas9進(jìn)行結(jié)合。該技術(shù)僅設(shè)計(jì)引導(dǎo)RNA 即可實(shí)現(xiàn)對(duì)含有PAM 序列的任一靶DNA序列進(jìn)行插入、敲除與定點(diǎn)突變等修飾。由于設(shè)計(jì)操作簡(jiǎn)單、通用性好及編輯效率高等優(yōu)勢(shì)，CRISPR/Cas9 的基因編輯技術(shù)已成為TALEN 與ZFN之后的新一代基因組編輯技術(shù)。

另外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還可以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)多個(gè)不同靶DNA 序列進(jìn)行編輯。利用CRISPR 位點(diǎn)自身的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)不同靶DNA 序列的間隔序列，插入到重復(fù)序列之間，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄加工后會(huì)形成多個(gè)可定位于不同靶DNA 序列的雙引導(dǎo)RNA，或者串聯(lián)不同的sgRNA均可實(shí)現(xiàn)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組的多個(gè)不同基因同時(shí)進(jìn)行編輯。

3 CRISPR技術(shù)的應(yīng)用

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)作為新興的基因編輯技術(shù)，目前已逐步在人類細(xì)胞、斑馬魚(yú)、小鼠、酵母、果蠅、細(xì)菌及水稻等作物中進(jìn)行研究并報(bào)道。

在作物新品種培育和改造時(shí)，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育和改造新品種一般采用利用外源基因隨機(jī)整合的方式，轉(zhuǎn)基因表達(dá)的可控性較差。而CRISPR/Cas9 技術(shù)則可以進(jìn)行定點(diǎn)修飾，達(dá)到高效定向。Shan 等用該技術(shù)敲掉了小麥的一個(gè)基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。該團(tuán)隊(duì)還利用CRISPR/Cas9 技術(shù)定點(diǎn)突變了小麥和水稻兩種作物的MLO 和PDS 等5 個(gè)基因。

在哺乳動(dòng)物的研究方面，研究人員采用該技術(shù)建立基因打靶小鼠，結(jié)果證實(shí)，采用該技術(shù)不僅可以通過(guò)非同源末端連接途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)靶基因的定點(diǎn)敲除，還可以通過(guò)同源重組途徑對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行靶向修飾。這些成果為其在生物工程、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、醫(yī)藥學(xué)科等多種領(lǐng)域中的應(yīng)用中提供了有力的基礎(chǔ)。

4 展望

CRISPR/Cas9 作為細(xì)菌最為簡(jiǎn)單的Ⅱ型獲得性免疫系統(tǒng)，被成功改造為繼TALEN 與ZFN 之后新一代基因組編輯技術(shù)，為基因組的定向改造調(diào)控與應(yīng)用等帶來(lái)突破性革命，且相對(duì)于TALEN 和ZFN，CRISPR/Cas9有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：（1）構(gòu)建和設(shè)計(jì)方法簡(jiǎn)單快捷，成本低廉，適用于任何分子生物實(shí)驗(yàn)室；（2）用于基因組的點(diǎn)突變編輯效率優(yōu)于ZFN和TALEN；（3）可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的打靶。可見(jiàn)，CRISPR/Cas9 在基礎(chǔ)理論研究、農(nóng)牧漁業(yè)和臨床治療等領(lǐng)域必將有越來(lái)越廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)然，目前關(guān)于CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還有許多亟待解決的問(wèn)題，相信隨著人們逐步深入和全面的研究，CRISPR/Cas9 技術(shù)將會(huì)展現(xiàn)出其無(wú)比強(qiáng)大的生命力。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Ishino Y， Shinagawa H， Makino K， et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product [J]. J Bacteriol， 1987， 169（12）：5429-5433.

[2]Marraffini L A， Sontheimer E J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science，2008，322（5909）：1843-1845.

[責(zé)任編輯：朱麗娜]