高淑慧 瞿創(chuàng) 吳鳳麟 沈晗

[摘要]目的 針對人源的CCL17和CCL22基因進行CRISPR/Cas9-gRNA設(shè)計，并驗證設(shè)計的sgRNA的有效敲除效率。方法 利用CRISPR網(wǎng)站提供的工具對CCL17和CCL22基因的靶向編輯位點進行篩選設(shè)計，然后構(gòu)建CRISPR-Cas9-CCL17和CRISPR-Cas9-CCL22敲除質(zhì)粒，并將構(gòu)建好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入293 T細胞系，然后通過基因組PCR產(chǎn)物的T-A克隆測序方法分別驗證設(shè)計的sgRNA敲除質(zhì)粒的編輯效率。結(jié)果 成功構(gòu)建針對于人源CCL17和CCL22基因的sgRNA敲除質(zhì)粒，并有著良好的編輯效率，均達70%以上。結(jié)論 針對CCL17和CCL22基因設(shè)計的CRISPR敲除質(zhì)粒對靶基因有著很好的編輯效果，為后續(xù)基于CCL17和CCL22的相關(guān)性研究奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]CRISPR；引導(dǎo)RNA；趨化因子；基因編輯

[中圖分類號] R319 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（c）-0004-05

Study on genome editing targeting CCL17 and CCL22 using CRISPR-Cas9 system

GAO Shu-hui QU Chuang WU Feng-lin SHEN Han▲

School of Biosciences and Biopharmaceutics，Guangdong Pharmaceutical University，Guangdong Province Key Laboratory for Biotechnology Drug Candidate，Guangzhou 510006，China

[Abstract]Objective To design CRISPR/Cas9-gRNA targeting human CCL17 and CCL22 gene，and to evaluate the editing effectiveness of the sgRNA.Methods The targeted editing sites of CCL17 and CCL22 genes were screened using tools provided by CRISPR website，then the knockout plasmid of CRISPR-Cas9-CCL17 and CRISPR-Cas9-CCL22 were constructed and separately transfected into 293 T cells.Finally，the T-A editing and sequencing methods of genomic PCR products were used to verify the editing efficiency of the designed sgRNA knockout plasmid.Results The knockout plasmid of CRISPR-sgRNA targeting human CCL17 and CCL22 gene was successfully constructed with high editing efficiency，reached more than 70%.Conclusion The CRISPR-Cas9-CCL17 and CRISPR-Cas9-CCL22 show good editing efficiency，which provide foundation for the deep research of the function on CCL17 and CCL22.

[Key words]Clustered regularly interspaced short palindromic reapeat；sgRNA；Chemokines；Genome editing

趨化因子是一組具有趨化作用的小分子蛋白，參與機體各種免疫細胞的遷移，并在局部免疫調(diào)節(jié)的各種組織中承擔重要功能。目前，已有眾多研究表明機體免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相互作用，而趨化因子因?qū)γ庖呒毎倪w移作用成為腫瘤研究中新的關(guān)注點[1]。CCL17，即胸腺和活化調(diào)節(jié)趨化因子（thymus and activation regulated che-mokine，TARC），與CCL22，即巨噬細胞來源的趨化因子（macrophage-derived che mokine，MDC）同為趨化因子大家族中的一員，人源基因均定位于染色體16q13，兩者有37%同源氨基酸序列[2-5]，且共有一個高親和力受體CCR4，是CC趨化因子受體（CC chemokine receptor，CCR），由Power等在嗜堿性粒細胞系中得到，具有蛋白激酶作用的磷酸化位點，廣泛表達于單核細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、NK細胞和T細胞等炎癥相關(guān)細胞[6-7]。最初的研究發(fā)現(xiàn)，CCL17和CCL22參與過敏性炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。一方面Semmling等[8]發(fā)現(xiàn)，在α-GC誘導(dǎo)的交叉免疫反應(yīng)中，CD8+ DC細胞在交叉提呈過程中分泌的趨化因子CCL17不僅能促進NKT細胞表達趨化因子受體CCR4并與其結(jié)合后刺激NKT細胞的活化，還能促進DC細胞與初始T細胞的接觸從而提高提呈效率，以發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。Naoko等[9]又發(fā)現(xiàn)，經(jīng)瘤內(nèi)注射AdRGD-CCL17顯著減緩了CT26腫瘤模型的疾病進展，且腫瘤消退主要與免疫效應(yīng)細胞在腫瘤組織部位浸潤相關(guān)。另一方面，在腫瘤免疫逃逸過程中發(fā)揮重要作用的Tregs細胞能夠有效抑制效應(yīng)T細胞的抗腫瘤作用，而Treg細胞表面表達CCR4受體，在Gobert等[10-13]的研究中，Treg細胞在腫瘤微環(huán)境中的遷移則主要通過趨化因子CCL22介導(dǎo)。

作為CCR4的高親和力受體，趨化因子CCL17和CCL22雖然在很多方面有相似性，但其在免疫系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用卻各有不同，因趨化因子主要是通過與其受體結(jié)合而發(fā)揮作用，而很多研究都是將CCR4基因沉默，同時抑制了CCL17和CCL22的功能，筆者分別針對人源CCL17和CCL22基因設(shè)計靶向CRISPR-sgRNA敲除質(zhì)粒，從而能更好地對趨化因子各自的功能進行更徹底的相關(guān)性研究[14]。

CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic reapeat/CRISPR-associated nuclease 9）系統(tǒng)是一種繼鋅指核酸酶之后的可對基因組進行靶向修飾的新型編輯技術(shù)，其開發(fā)具有成本低、易于構(gòu)建、編輯效率高等優(yōu)勢，在研究中的應(yīng)用更為廣泛[15-17]。本實驗選用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人源性趨化因子CCL17和CCL22基因進行了基因編輯方面的探索性研究，旨在為后續(xù)趨化因子CCL17和CCL22的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

pX458質(zhì)粒為實驗室保存菌種；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)購自廣州TAKARA代理公司；pGEM-T Easy Vector與T4DNA連接酶購自Promega公司；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit與PCR Cleanup Kit試劑盒購自AXYGEN公司；BbsⅠ限制性內(nèi)切酶與DNA聚合酶購自廣州NEB代理公司；引物與sgRNA均由英濰捷基公司合成。

1.2靶向sgRNA的設(shè)計及寡核苷酸鏈合成

通過NCBI網(wǎng)站得到目的基因CCL17和CCL22的基因序列，然后綜合多個設(shè)計sgRNA的網(wǎng)站篩選結(jié)果與PAM位點原則獲得20個堿基，同時在正向5′端加堿基序列”cacc”，反向5′端加堿基序列”aaac”，使sgRNA的黏性末端能與BbsⅠ酶切后的黏性末端互補（表1）。

表1 CCL17、CCL22gRNA核心序列

1.3 pX458-sgRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建

將公司合成的sgRNA序列稀釋至一定濃度，然后進行磷酸化修飾，產(chǎn)物置于4℃保存。利用限制性內(nèi)切酶BbsⅠ將pX458質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物進行切膠回收后與載體進行4℃過夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)DH5α，培養(yǎng)后挑選陽性單克隆菌落搖菌后取部分菌液送去測序。

1.4 pX458質(zhì)粒功能的驗證

1.4.1細胞轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的293 T細胞經(jīng)消化處理成單細胞懸液后進行計數(shù)，以每孔5×106個細胞種于六孔板中，待8～10 h細胞貼壁后密度達到80%，磷酸鈣轉(zhuǎn)染法將前期構(gòu)建成功的pX458-CCL17和pX458-CCL22敲除質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293 T細胞。24 h后可通過熒光倒置顯微鏡來觀察綠色熒光蛋白的表達情況，72 h后可借助流式細胞儀來檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2細胞基因組DNA的提取和PCR擴增 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒提取72 h后293 T細胞的基因組DNA。針對靶向基因CCL17和CCL22篩選的sgRNA位點，在位點300～500 bp附近設(shè)計一對引物（CCL17 Knockout-F：5′-AGATCTTCCACGAACACCCC-3′；CCL17Knockout-R：5′-AATAGGTTGGACCTCATGGC-3′；CCL22 Knockout-F：5′-CCCCGCTCCTAGAGCTGACT-3′；CCL22 Knockout-R：5′-TCTGGTAGCCCTGCCACATT-3′）進行編輯后基因組DNA擴增，將擴增好且條帶正確的PCR產(chǎn)物送去公司測序。

1.4.3 PCR產(chǎn)物純化、T載體連接及測序 對PCR測序結(jié)果進行分析，選擇有套峰出現(xiàn)的PCR產(chǎn)物經(jīng)AxyPrep PCR Cleanup Kit試劑盒純化后測定產(chǎn)物濃度，然后與pGEM-T載體4℃過夜連接，將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，37℃培養(yǎng)12～16 h，然后挑取陽性單克隆菌落搖菌并進行菌液PCR測序，將測序結(jié)果進行相應(yīng)的分析統(tǒng)計。

2結(jié)果

2.1 pX458-sgRNA質(zhì)粒載體的構(gòu)建分析

連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌挑取單菌落后用U6、sgRNA反向序列作上下游引物經(jīng)PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，將出現(xiàn)目的條帶的菌液進行測序，用軟件分析測序后堿基序列，如圖1所示，即陽性菌落測出的堿基序列與設(shè)計的sgRNA序列完全相同，確定在酶切位點成功插入sgRNA，由此，靶向CCL17和CCL22基因的敲除質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 所構(gòu)建pX458質(zhì)粒的測序結(jié)果

2.2 pX458質(zhì)粒的細胞轉(zhuǎn)染效率分析

處理轉(zhuǎn)染時間達72 h的細胞，以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組作空白對照，通過流式細胞儀檢測敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的綠色熒光蛋白的表達情況從而計算轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果如圖2所示。

Control：未轉(zhuǎn)pX458敲除質(zhì)粒的陰性組；CCL17、CCL22：相應(yīng)pX458敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組

圖2 PX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率的檢測結(jié)果

2.3 pX458質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后編輯功能的檢測

分別將轉(zhuǎn)染pX458-CCL17與pX458-CCL22質(zhì)粒的各細胞組經(jīng)消化處理后提取293 T細胞基因組的DNA，根據(jù)設(shè)計好的PCR產(chǎn)物進行擴增，然后測序分析，發(fā)現(xiàn)陰性未轉(zhuǎn)染組在PAM位點基本都是單一的峰，而pX458-CCL17與pX458-CCL22質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組在PAM位點前3個堿基處開始出現(xiàn)明顯的套峰（如圖3A），提示設(shè)計的sgRNA均有良好的靶向性。T-A克隆后，將出現(xiàn)條帶的菌液送測序后分析測序結(jié)果，靶向CCL17基因的10個測序樣品中有9個克隆出現(xiàn)編輯情況，如圖3B所示，有2個克隆在同一位點發(fā)生9個堿基的缺失，其余7個則是在不同位點發(fā)生缺失情況，且堿基的缺失數(shù)目也不同，由此得出pX458-CCL17敲除質(zhì)粒的編輯效率為90%。靶向CCL22基因共有6個克隆出現(xiàn)了編輯情況，如圖4B所示，有1個克隆出現(xiàn)1個A/T堿基的插入，其余5個則是不同堿基數(shù)目的缺失，共送樣20個陽性克隆測序，考慮到其轉(zhuǎn)染效率，由此得出pX458-CCL22敲除質(zhì)粒的編輯效率為73.2%。

A.基因組PCR測序結(jié)果；B.基因組PCR的T-A克隆測序結(jié)果

“-”表示堿基序列的丟失，“+”表示堿基序列的插入，“*”表示該編輯序列在測序中重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)

圖3 CCL17-sgRNA的編輯效率結(jié)果

A.基因組PCR測序結(jié)果；B.基因組PCR的T-A克隆測序結(jié)果

“-”表示堿基序列的丟失，“+”表示堿基序列的插入，“*”表示該編輯序列在測序中重復(fù)出現(xiàn)的次數(shù)

圖4 CCL22-sgRNA的編輯效率結(jié)果

3討論

隨著腫瘤免疫研究的發(fā)展，機體免疫系統(tǒng)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸方面的相關(guān)作用機制逐漸成為熱點，趨化因子能夠趨化各種免疫細胞的遷移，因而在機體免疫調(diào)節(jié)中承擔著重要功能。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子參與腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)，影響腫瘤進展。Henry等[18-19]的研究發(fā)現(xiàn)，DC細胞能夠分泌趨化因子CCL17促進與初始T細胞的活化作用，增強抗腫瘤免疫作用。又有報道顯示，在卵巢癌中趨化因子CCL22能夠通過與CCR4結(jié)合趨化Treg細胞的遷移從而抑制殺傷性T細胞的抗腫瘤作用[20]。雖CCL17與CCL22有共同的高親和力受體CCR4，但兩者在腫瘤免疫中的作用機制仍備受爭議[21-22]。由于以往研究大多是將CCR4受體抑制后再進行相關(guān)研究，從而無法直接對CCL17和CCL22各自的功能進行研究，于是本文結(jié)合日漸成熟的CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，分別針對CCL17和CCL22基因設(shè)計靶向sgRNA，從而能夠為CCL17和CCL22兩者更嚴謹?shù)难芯刻峁┕ぞ撸於ɑA(chǔ)。

CRISPR/Cas9靶向基因編輯系統(tǒng)是繼鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）[23]和轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）[24]之后的新型定點編輯技術(shù)，但后兩者的篩選和組裝過程都需要較高的技術(shù)要求，并且潛在的細胞毒性問題也需要后續(xù)研究，而CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)則具有成本高、易于構(gòu)建及編輯效率高等優(yōu)勢，其開發(fā)為基因定點修飾技術(shù)提供了新的平臺，越來越成為研究的熱點[25]。

本研究則利用CRISPR/Cas9編輯系統(tǒng)對趨化因子CCL17和CCL22進行定點編輯，在構(gòu)建載體時選用pX458質(zhì)粒，質(zhì)粒上帶有BbsⅠ酶切位點，在設(shè)計的sgRNA上添加黏性末端則可連入pX458質(zhì)粒，操作簡單。根據(jù)前期對sgRNA的PAM結(jié)構(gòu)的相關(guān)設(shè)計原則研究，選取編輯效率最好的NGG（N可以為A/T/C/G）結(jié)構(gòu)5′端的20個堿基作為靶向序列，并聯(lián)合多個設(shè)計網(wǎng)站綜合評分設(shè)計出sgRNA-CCL17和sgRNA-CCL22。成功構(gòu)建pX458-CCL22和pX458-CCL22敲除質(zhì)粒后，在編輯效率的驗證過程中，由于同一基因在同一種屬的不同細胞中的基因組序列是相同的，因此選取常規(guī)的磷酸鈣轉(zhuǎn)染293 T細胞來驗證敲除效率。因轉(zhuǎn)染效率未達到預(yù)期效果，利用pX458自身帶有的綠色熒光報告蛋白將細胞進行流式分選，將轉(zhuǎn)染成功的細胞分選后再進行基因組的提取及后續(xù)研究，通過編輯后的測序分析，發(fā)現(xiàn)通過將細胞分選后再進行基因組的提取及后續(xù)PCR產(chǎn)物擴增，編輯情況及編輯效率則能更徹底地顯現(xiàn)。測序結(jié)果顯示，雖然針對兩個基因在設(shè)計sgRNA時遵循的設(shè)計原則相同，但在實際的編輯中效率仍會出現(xiàn)差異，分析原因應(yīng)與基因自身的sgRNA有關(guān)，因而在設(shè)計sgRNA時應(yīng)綜合考慮，盡量遵循已報道的具有高編輯效率的序列特點。此外，與良好的編輯效率相比，今后的實驗還應(yīng)考慮到基因編輯的脫靶率的相關(guān)研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建分別針對于人源CCL17和CCL22基因的CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒，并通過驗證，設(shè)計的sgRNA序列具有較好的編輯效率，為趨化因子CCL17和CCL22在腫瘤免疫中后續(xù)的研究提供了工具，奠定了基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2018-01-30 本文編輯：祁海文）