史珂雨，趙慧琳，李明鑫，秦兆盈，吳迪，杜明，王聰

（1.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器中心，遼寧 大連 116034）

目前，人工合成的降血壓藥物有200余種，但需要終身口服，而且大多存在引起低血壓、咳嗽、血鉀升高、胎兒畸形等副作用。因此，急需開(kāi)發(fā)安全性更高的食源性血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin I-converting enzyme，ACE）抑制肽。

核桃具有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，在我國(guó)中醫(yī)藥學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用。核桃仁營(yíng)養(yǎng)豐富，含有16%～19%的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)[1]。以核桃為基料的ACE抑制肽研究，在酶法水解工藝篩選、分離純化條件優(yōu)化等方面已經(jīng)積累了比較豐富的經(jīng)驗(yàn)，在結(jié)構(gòu)鑒定和構(gòu)效關(guān)系方面也開(kāi)始進(jìn)行逐步深入的探討。隨著科技飛速進(jìn)步，將新興的計(jì)算機(jī)生物信息技術(shù)與傳統(tǒng)多肽研究方法相結(jié)合的探索，即將展現(xiàn)出特有的優(yōu)勢(shì)。

生物信息學(xué)方法主要依賴于大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)，以此為基礎(chǔ)對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的各種生物信息、活性功能、分子間作用機(jī)理進(jìn)行分析判斷，可以減少生物制備純化鑒定的繁瑣工序和制備成本，加快試驗(yàn)進(jìn)程[2-5]。隨著ACE抑制肽的廣泛深入研究，蛋白一級(jí)序列數(shù)據(jù)庫(kù)的逐步建立，利用計(jì)算機(jī)模擬復(fù)合酶水解蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽的這種思路，對(duì)于實(shí)踐操作具有較好的指導(dǎo)作用。利用生物信息技術(shù)闡述ACE抑制肽分子特性，尤其是氨基酸在其中的分布規(guī)律，分析核桃蛋白酶解產(chǎn)物中降血壓肽的分布情況，對(duì)于ACE抑制肽的分離純化及構(gòu)效關(guān)系研究具有重要的指導(dǎo)作用，對(duì)于核桃降血壓肽的深度開(kāi)發(fā)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 ACE抑制肽分子信息庫(kù)建立

ACE抑制肽的分子信息收集主要來(lái)自于兩部分，絕大部分從BIOPEP數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得[6]，另外一部分從Web of Science等文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得。

1.2 ACE抑制肽的分子特性與結(jié)構(gòu)分析

主要關(guān)注ACE抑制肽的幾方面信息：分子量、等電點(diǎn)、表面凈電荷、疏水性、N-末端氨基酸、C-末端氨基酸等，建立這些分子信息與ACE抑制活性之間的內(nèi)在規(guī)律性聯(lián)系。為后續(xù)ACE抑制肽的分離制備、活性分析及構(gòu)效關(guān)系研究提供一定的理論參考。

1.3 虛擬酶切數(shù)據(jù)庫(kù)選擇

采用PeptideCutter軟件數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬酶切位點(diǎn)分析，該數(shù)據(jù)庫(kù)的互聯(lián)網(wǎng)地址為https：//web.expasy.org/peptide_cutter/[7]。

1.4 核桃蛋白虛擬酶切位點(diǎn)分析

核桃種子儲(chǔ)藏蛋白（GeneBank：AAW29810.1）分子由507個(gè)氨基酸組成，序列從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ncbisearch）中獲得[8]。采用PeptideCutter進(jìn)行虛擬酶切位點(diǎn)分析，主要選取胃腸消化道中常見(jiàn)的蛋白酶。通過(guò)酶切位點(diǎn)分析推測(cè)其酶切產(chǎn)物，進(jìn)而將這些虛擬酶切產(chǎn)物的氨基酸序列作為產(chǎn)物活性判定的依據(jù)之一。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACE抑制肽分子組成與活性關(guān)系分析

本研究經(jīng)過(guò)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)總結(jié)歸納，選取了目前報(bào)道的691條具有ACE抑制活性的肽段，針對(duì)這些ACE抑制肽的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)展開(kāi)分析，建立了這些分子信息與ACE抑制活性之間的內(nèi)在規(guī)律性聯(lián)系。

ACE抑制肽的肽鏈長(zhǎng)度和分子量的分布情況見(jiàn)圖1。

圖1 ACE抑制肽的肽鏈長(zhǎng)度和分子量的分布情況Fig.1 Relationship of peptide chain length and ACE activity

研究顯示ACE抑制肽的降壓活性與其相對(duì)分子質(zhì)量大小、肽鏈長(zhǎng)度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)（如圖1），ACE抑制肽通常含有2個(gè)～20個(gè)氨基酸。由圖1a可知，長(zhǎng)度在2個(gè)～5個(gè)氨基酸的肽有415條、6個(gè)～10個(gè)氨基酸的肽有230條、10個(gè)～15個(gè)氨基酸的肽有41條、16個(gè)～20個(gè)氨基酸的肽只有5條，分別占到所匯總ACE抑制肽總數(shù)的60.06%、33.28%、5.93%和0.72%。肽鏈含有2個(gè)～5個(gè)氨基酸的短肽出現(xiàn)的頻率最高。肽的分子量與肽鏈長(zhǎng)度成正比，綜合考慮大部分肽的純化鑒定等研究中，均與分子量直接關(guān)聯(lián)，因此也應(yīng)該針對(duì)分子量進(jìn)行分析。

由圖1b可知，分子量分布在500 Da以下的肽有315條、500 Da～1 000 Da的肽有274條、1 000 Da～1 500 Da的肽有79條、1 500 Da～2 000 Da的肽有21條、而分子量大于2 000 Da的肽僅有2條，分別占到所匯總ACE抑制肽總數(shù)的45.58%、39.65%、11.43%、3.04%和0.29%。從統(tǒng)計(jì)學(xué)的規(guī)律來(lái)看，分子量小于1 000 Da的ACE抑制肽所占比例較大，其中分子量500 Da以下的ACE抑制肽比例最大。這說(shuō)明小分子肽更容易進(jìn)入到ACE活性中心，發(fā)揮抑制作用。而肽鏈長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，影響活性肽進(jìn)入到ACE三級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，可能由于空間位阻效應(yīng)，不利于與ACE活性位點(diǎn)結(jié)合。

2.2 ACE抑制肽末端氨基酸與活性關(guān)系分析

ACE抑制肽的末端氨基酸分布情況見(jiàn)圖2。

圖2 ACE抑制肽的末端氨基酸分布情況Fig.2 Relationship of amino acid properties of peptides and ACE activity

目前，ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系還沒(méi)有徹底闡明，但是研究普遍認(rèn)為，ACE抑制肽的抑制活性和其自身的結(jié)構(gòu)和氨基酸順序有關(guān)。由圖2a可知，對(duì)ACE抑制肽的N-末端氨基酸分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)有8種氨基酸在ACE抑制肽的N-末端出現(xiàn)的頻率較高，它們分別為 Leu、Val、Tyr、Ala、Ile、Gly、Pro和Phe。其中Leu出現(xiàn)頻率最高為12.15%，其余7種氨基酸的出現(xiàn)頻率分別為9.69%、8.83%、8.10%、7.81%、7.67%、7.23%和6.08%。同時(shí)，從中也發(fā)現(xiàn)Asp、Trp和Cys在ACE抑制肽的N-末端出現(xiàn)頻率很低，分別為1.59%、1.30%、0.43%，說(shuō)明這些氨基酸在肽鏈的N-末端時(shí)，其降血壓活性可能處在較低水平。

由圖2b可知，對(duì)691種ACE抑制肽的C-末端氨基酸進(jìn)行分析研究，Pro表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，在C-末端出現(xiàn)頻率達(dá)到29.96%。此外，還有7種主要氨基酸在ACE抑制肽的C-末端出現(xiàn)的頻率較高，它們分別為Tyr、Lys、Arg、Leu、Phe、Ala 和 Gly，對(duì)應(yīng)出現(xiàn)頻率分別為 10.27% 、8.25% 、6.22% 、5.93% 、5.64% 、5.21% 和5.06%，主要為芳香族氨基酸（Tyr、Phe）、帶正電荷的堿性氨基酸（Lys、Arg）或側(cè)鏈脂肪烴氨基酸（Leu、Ala和Gly），同時(shí)，從圖中也發(fā)現(xiàn) Met、Asp、Asn、Ile 和 His在ACE抑制肽的C-末端出現(xiàn)頻率很低，對(duì)應(yīng)出現(xiàn)頻率分別為0.29%、0.87%、1.16%、1.30%和1.30%，而Cys在C-末端甚至沒(méi)有出現(xiàn)，說(shuō)明這些氨基酸在肽鏈的C-末端時(shí)，其降血壓活性可能不高。

2.3 ACE抑制肽分子表面電荷與活性關(guān)系分析

ACE抑制肽的等電點(diǎn)及凈電荷分布情況見(jiàn)圖3。

圖3 ACE抑制肽的等電點(diǎn)及凈電荷分布情況Fig.3 Relationship of pI and charge of peptides and ACE activity

在對(duì)ACE抑制肽分子特性與構(gòu)效關(guān)系的研究中，關(guān)于肽的等電點(diǎn)和凈電荷對(duì)ACE抑制活性的作用效果的探討很少見(jiàn)。由圖3a可以看出，等電點(diǎn)在pH 7以下的肽共有460條，占所統(tǒng)計(jì)肽總數(shù)的66.57%；等電點(diǎn)在pH 8以上的肽共有224條，占所統(tǒng)計(jì)肽總數(shù)的32.42%；等電點(diǎn)在pH 7～8即生理pH左右的肽僅有7條，僅占所統(tǒng)計(jì)肽總數(shù)的1.01%。由圖3b可以看出，691種ACE抑制肽的凈電荷規(guī)律以不帶電或者帶一個(gè)正電荷為主，帶正電荷的肽有286條，占所統(tǒng)計(jì)肽總數(shù)的41.39%；不帶電荷的肽有325條，占所統(tǒng)計(jì)肽總數(shù)的47.03%；而帶有負(fù)電荷的肽僅有80條，占所統(tǒng)計(jì)肽總數(shù)的11.58%。因此推測(cè)負(fù)電荷對(duì)抑制活性的促進(jìn)作用不明顯?？傮w來(lái)看，不帶電或帶有少量正電荷更有利于發(fā)揮ACE抑制活性。

ACE抑制肽的等電點(diǎn)數(shù)值基本集中在pH 5～7和pH 8～10兩個(gè)范圍內(nèi)，分別占比55.86%和28.94%。在pH 7.3左右的范圍內(nèi)，具有活性的ACE抑制肽非常少。分析這種情況可知，活性肽在等電點(diǎn)附近會(huì)聚集變性，不能與ACE分子順利結(jié)合而失去生理活性，而等電點(diǎn)pH5～7或pH8～10的ACE抑制肽則可以在生理pH條件下帶正電荷或者負(fù)電荷，有帶電荷和羧酸基團(tuán)的肽與ACE更容易形成氫鍵[9]。這樣更容易與ACE分子之間形成氫鍵或者凈電荷相互作用，有利于肽與ACE之間形成穩(wěn)定的復(fù)合結(jié)構(gòu)。

2.4 ACE抑制肽疏水性與活性關(guān)系分析

ACE抑制肽的親水指數(shù)和親水氨基酸分布情況見(jiàn)圖4。

圖4 ACE抑制肽的親水指數(shù)和親水氨基酸分布情況Fig.4 Relationship of hydrophilicity of peptides and ACE activity

疏水性是活性肽的重要分子特性之一，肽段的親水疏水值可能會(huì)影響其與ACE結(jié)合的效果。由圖4a可見(jiàn)，據(jù)本研究涉及的ACE抑制肽統(tǒng)計(jì)可知，其肽段整體親水性值小于0的有465條，占所分析總數(shù)的67.29%；整體親水性值大于0的有181條，占所分析總數(shù)的26.19%。說(shuō)明這些ACE抑制肽中，親水性較弱而疏水性相對(duì)較強(qiáng)的肽段所占比重較大。圖4b顯示，ACE抑制肽氨基酸組成中所含有的親水氨基酸含量并不高，肽鏈中親水氨基酸百分比含量小于50%的567條肽，在全部統(tǒng)計(jì)肽段中占比82.05%；而親水氨基酸含量大于或等于50%的肽段只有124條，在全部統(tǒng)計(jì)肽段中占比17.94%。即大部分的ACE抑制肽中親水性氨基酸含量較低。

上述這些結(jié)果可以作為實(shí)際研究中的理論參考，在篩選確定ACE抑制肽過(guò)程中明確研究方向，制定制備策略等方面具有良好的指導(dǎo)作用。

2.5 核桃ACE抑制肽的虛擬酶切產(chǎn)物及分析

核桃種子儲(chǔ)藏蛋白的分子量為58 144.5 Da，理論等電點(diǎn)為7.0[7-8]。平均親水性是根據(jù)多肽序列中所有氨基酸殘基以及它們所帶不同修飾基團(tuán)的親/疏水值計(jì)算的。經(jīng)過(guò)分析，核桃種子儲(chǔ)藏蛋白分子的平均親水性值是0.3，親水氨基酸殘基在分子中所占的比例為49%。從這個(gè)蛋白質(zhì)的平均親水性值，可以判斷其在水相體系中的溶解性比較好。

本研究根據(jù)核桃種子儲(chǔ)藏蛋白的氨基酸序列，采用 PeptideCutter數(shù)據(jù)庫(kù)工具（https：//web.expasy.org/peptide_cutter/）[7]，進(jìn)行其虛擬酶切位點(diǎn)分析。雖然中性蛋白酶和堿性蛋白酶也屬于內(nèi)切酶，在目前食品工業(yè)中廣泛用于酶解蛋白質(zhì)生產(chǎn)活性肽，但由于這兩種酶切位點(diǎn)幾乎沒(méi)有序列特異性，隨機(jī)性很強(qiáng)，很難控制切割的氨基酸殘基位置，產(chǎn)物難以預(yù)測(cè)，所以在選擇虛擬酶切的蛋白酶時(shí)不考慮這兩種酶。從PeptideCutter數(shù)據(jù)庫(kù)中，選取Arg-C蛋白酶[10]、Asp-N端肽酶[11]、Asp-N端肽酶+N端Glu[12]、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶[13]、高專一性胰凝乳蛋白酶[14]、低專一性胰凝乳蛋白酶[15]、谷氨酰內(nèi)肽酶[16]、胃蛋白酶（pH1.3）[17]、胃蛋白酶（pH>2）[18]、脯氨酸肽鏈內(nèi)切酶[19]、蛋白酶 K[20]、葡萄球菌肽酶I[21]、嗜熱菌蛋白酶[22]、胰蛋白酶[23]這14種較為常見(jiàn)的蛋白酶進(jìn)行虛擬酶切分析。

研究表明，組織蛋白酶C是一種巰基蛋白酶，可以水解氨基端雙肽，可通過(guò)K、R或P氨基端作為第二或第三個(gè)氨基酸進(jìn)行封閉；胰凝乳蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)是在F-Phe、T-Thr或Y-Tyr之后；內(nèi)肽酶Arg-C是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)是在R-Arg之后[10]；內(nèi)肽酶Asp-N是一種金屬蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)是在D-Asp和C-Cys半胱氨酸之前[11]；內(nèi)肽酶Glu-C是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)是在E-Glu/Gln或D-Asp之后；內(nèi)肽酶Lys-C是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)是在K-Lys之后；蛋白酶K是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)具有廣泛特異性[20]；枯草桿菌蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，水解位點(diǎn)無(wú)特異性；胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶，特異性水解位點(diǎn)是在K-Lys或R-Arg之后[23]。胃蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的酶切位點(diǎn)具有一定的氨基酸序列特異性，優(yōu)先水解N-末端或C-末端為芳香族氨基酸（Phe、Trp和Tyr）或Leu的肽鍵。關(guān)于不同蛋白酶的酶切位點(diǎn)與核桃種子儲(chǔ)藏蛋白氨基酸序列之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1和圖5所示。

表1 核桃種子儲(chǔ)藏蛋白的理論酶切位點(diǎn)（100%可能性）Table 1 Theoretical enzyme cutting site of walnut seed storage protein（100% possibility）

圖5 核桃種子儲(chǔ)藏蛋白的虛擬酶切位點(diǎn)分析Fig.5 Analysis of the virtual enzyme cutting site of walnut seed storage protein

3 結(jié)論

本研究建立了ACE抑制肽分子結(jié)構(gòu)信息與ACE抑制活性之間的內(nèi)在規(guī)律性聯(lián)系。其中，分子量小于1 000 Da尤其是500 Da以下的ACE抑制肽占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，并且 Pro、Tyr、Leu、Phe和 Ala這幾種氨基酸在ACE抑制肽分子末端出現(xiàn)的頻率較高；這些肽分子的理論等電點(diǎn)在pH 5～7區(qū)間分布較多，而且這些肽中親水性氨基酸含量通常較低。另外，核桃儲(chǔ)藏蛋白的虛擬酶切分析表明，組織蛋白酶K的酶切位點(diǎn)最多，約占總肽鍵數(shù)量的50%以上；人體消化道中常見(jiàn)的胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶，在酶解制備核桃蛋白多肽中也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。該研究為以核桃蛋白為原料的ACE抑制肽的制備提供了一定的理論參考。