焦璐，巨家升，周連玉，馬學(xué)蘭

（青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海省青藏高原生物多樣性形成機制與綜合利用重點實驗室，青海 西寧 810008）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一種革蘭氏陽性異養(yǎng)型細菌，能夠利用碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生乳酸[1]。常見的種屬包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、片球菌屬（Pediococcus）等。而乳酸菌在生長過程中會產(chǎn)生各種酸、胞外多糖、氨基酸等代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有增強免疫力、抑菌、維持腸道菌群平衡等功效[2-3]。

硒是人體和動物必需礦質(zhì)元素之一，具有增強免疫力、抗癌、抗氧化等生理功能[4-5]。硒的價態(tài)一般為元素硒（0）、硒化物（Ⅱ）、亞硒酸鹽（Ⅳ）和硒酸鹽（Ⅵ），其化學(xué)形式影響著功能的發(fā)揮[6]。一些研究者通過生物富集法將有毒性的無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，這樣就降低無機硒的毒副作用，并提高了硒的生理活性和吸收率[7]。乳酸菌作為人體內(nèi)的益生菌，被諸多研究證實了具有硒富集及轉(zhuǎn)化硒的能力，其富硒代謝產(chǎn)物具有多種生理功能。

1 乳酸菌富硒能力與影響因子

乳酸菌具有不同的富硒能力，其富硒率又與多種環(huán)境因素有關(guān)。將植物乳桿菌分別接入濃度為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 μg/mL的亞硒酸鈉溶液的改良液體培養(yǎng)基（deman rogosa sharpe，MRS）中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)富硒率先隨硒濃度增加而升高，當亞硒酸鈉濃度為5 μg/mL時富硒率達到最高值34.91%；而當硒濃度超過5 μg/mL時富硒率下降至26.40%[8]。植物乳桿菌在適宜的亞硒酸鈉濃度下才能表現(xiàn)出最大的富硒能力。將同種乳酸菌培養(yǎng)在添加6 μg/mL亞硒酸鈉的改良MRS液體培養(yǎng)基中，梁金鐘等[8]與曾議霆等[9]研究得到的富硒量分別為634.76 μg/g和 425.79 μg/g；可能與各自培養(yǎng)時間不同有關(guān)聯(lián)，前者培養(yǎng)36h，而后者培養(yǎng)了24h。

培養(yǎng)基中的氮源、碳源和礦質(zhì)元素為菌株生長提供營養(yǎng)成分和能量物質(zhì)，選擇適宜的培養(yǎng)基成分可促進乳酸菌增殖能力和富集能力。通過優(yōu)化培養(yǎng)基中碳源、氮源、緩沖鹽和硒的濃度，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在含有2%葡萄糖、3%牛肉粉∶酵母粉（1∶2）、0.6%磷酸氫二鉀、4 μg/mL硒濃度的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，活菌數(shù)可達到4.9×109cfu/mL，富硒率為52.5%[10]。而將同種乳酸菌培養(yǎng)在添加相同硒濃度不同配方的液體培養(yǎng)基中，其富硒率存在差異。王洋等[11]將動物雙歧桿菌01加入硒濃度為8 μg/mL的南瓜汁培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，其富硒率僅為6.41%，而靳志強等[12]利用改良MRS液體培養(yǎng)基富硒培養(yǎng)動物雙歧桿菌01，所得富硒率為22.4%。王洋等[11]利用南瓜汁培養(yǎng)基對多種雙歧桿菌菌株進行富硒培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各種菌株富硒率變化范圍為1.76%～6.41%。此結(jié)果說明了在相同的培養(yǎng)基中同種乳酸菌的不同菌株富硒能力也存在差異，這可能是由于不同菌株之間的基因型存在差異性而導(dǎo)致的。

不同時期的乳酸菌對培養(yǎng)液中物質(zhì)的吸收能力表現(xiàn)出差異性。分別將一定量的亞硒酸鈉溶液在動物雙歧桿菌 01培養(yǎng)初期（0 h）、對數(shù)生長期（4、6、10 h）以及穩(wěn)定期（14 h）加入MRS液體培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，于6 h加入亞硒酸鈉得到菌體硒含量和細胞硒轉(zhuǎn)化率均達到最大值，分別為969 μg/g和22.4%[12]。由此可見，乳酸菌在對數(shù)期表現(xiàn)出旺盛的活力，有利于吸收硒和轉(zhuǎn)化無機硒。富硒鼠李糖乳桿菌同樣在對數(shù)期第6小時加硒，富硒率約65%[13]，與靳志強等[12]研究結(jié)果相比增加了42.6%，可能是與菌株不同有關(guān)。乳酸菌的富硒能力與其培養(yǎng)時間有關(guān)，董曉芬等[14]從枳椇果梗中篩選出一株富硒能力強且適宜發(fā)酵枳椇液的屎腸球菌，發(fā)現(xiàn)當培養(yǎng)時間為3、15、21 h時分別表現(xiàn)出菌株的對數(shù)生長期、穩(wěn)定期和降解期，而當培養(yǎng)時間為15 h～18 h時菌株的生長情況良好，在最適條件下培養(yǎng)富硒率可達39.06%。

乳酸菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的酸降低培養(yǎng)液中pH值[15]，而大量的氫離子影響硒離子與細胞表面的結(jié)合，從而使菌體的富硒率降低[16]。分別調(diào)節(jié)硒濃度為5 μg/mL 的 MRS 液體培養(yǎng)基的 pH 值為 4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，然后接入植物乳桿菌，試驗結(jié)果顯示菌體富硒量先隨pH值升高而增加，當pH值為5.5時達到最高值為739.544 μg/g；而超過pH5.5時，富硒量呈下降趨勢[8]。利用同種乳酸菌培養(yǎng)在添加相同亞硒酸鈉濃度和接種量的番茄汁液體培養(yǎng)基中，得到的富硒率分別為62.22%和72.17%[17-18]，其差異可能與各自pH值有關(guān)，前者pH值為6.6，后者pH值為6.8。這些研究證實了培養(yǎng)液的pH值過高過低都會抑制乳酸菌富硒能力。另外，通過測定培養(yǎng)液pH值來確定加硒的濃度范圍。朱何東等[19]將布氏乳桿菌分別接種到含Na2SeO3溶液 40、45、50 μg/mL 的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，通過測定培養(yǎng)液pH值來判斷菌體是否正常產(chǎn)酸，結(jié)果表明在Na2SeO3濃度為40 μg/mL～50 μg/mL條件下菌體產(chǎn)酸正常。

接種量和種齡在一定程度上對乳酸菌富硒能力有影響。接種量過多，乳酸菌繁殖過盛導(dǎo)致發(fā)酵液營養(yǎng)缺失，生物量減少；接種量過少，乳酸菌生長緩慢，影響發(fā)酵時間。李艷嬌等[20]通過比較不同的接種量對乳酸菌富硒量的影響，研究發(fā)現(xiàn)富硒量先隨接種量升高而增加，當接種量為9%時富硒量達到最高值8 g/L，而接種量超過9%時，富硒量呈下降趨勢。乳酸菌種齡時間過長或過短均會出現(xiàn)生長緩慢或衰老等現(xiàn)象。據(jù)研究報道接入種齡為9 h～15 h的乳酸菌，其富硒量和富硒能力均較高，而種齡低于9 h或高于15 h，乳酸菌生長不佳[21]。因此在實踐中應(yīng)選擇適宜的接種量和種齡來提高乳酸菌富硒能力。

硒濃度、加硒時間、培養(yǎng)時間、pH值、接種量和培養(yǎng)基等諸多培養(yǎng)條件都影響著乳酸菌的富硒能力，各因素之間存在著相互作用。通過響應(yīng)面及等高線分析可知，加硒時間與接種量、初始pH值與接種量兩兩之間具有良好的交互作用，根據(jù)二次多項回歸模型方程得到最優(yōu)富硒培養(yǎng)條件為加硒時間7.59 h、初始pH5.43、接種量3.26%[8]。徐穎等[13]報道了影響鼠李糖乳桿菌富硒率大小的主次因素依次為加硒時間、硒濃度和培養(yǎng)溫度。此外，培養(yǎng)溫度、接種量、硒濃度、培養(yǎng)溫度與接種量之間的一次交互作用是影響乳酸菌富硒量的主要因素[21]。以富硒率為指標，需要選擇多種因素的試驗設(shè)計方案來優(yōu)化乳酸菌富硒培養(yǎng)條件，有利于找出富硒最佳的培養(yǎng)條件，以提高乳酸菌的富硒能力。

2 乳酸菌轉(zhuǎn)化硒形態(tài)及含量

乳酸菌可以吸收無機硒，經(jīng)過菌體代謝將不同價態(tài)的無機硒轉(zhuǎn)換成不同形態(tài)的有機硒，如硒蛋白、硒多糖、硒核酸等，以及單質(zhì)硒。其中硒蛋白主要包括硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸等，乳酸菌轉(zhuǎn)化硒形態(tài)見表1。

表1 乳酸菌轉(zhuǎn)化硒的形態(tài)Table 1 Biotransformation of selenium by lactic acid bacteria

梁佳等[22]對雙歧桿菌進行富硒培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)菌體含硒氨基酸為硒代蛋氨酸，占總硒含量的（59.55±0.13）%。另外，在酸奶中加入亞硒酸鈉，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法發(fā)現(xiàn)，乳酸菌可將其轉(zhuǎn)化為硒代胱氨酸和甲基硒代半胱氨酸，含量范圍分別為69 ng/g～542 ng/g和90 ng/g～272 ng/g[23]。

許多微生物能將培養(yǎng)系統(tǒng)中的無機硒進行富集后，使其與多糖分子結(jié)合形成硒多糖。曾議霆[24]對富硒優(yōu)勢菌株植物乳桿菌BC-25進行富硒培養(yǎng)后，采用乙醇沉淀法獲得324.80 mg/L胞外硒多糖。經(jīng)過層析柱分離純化以及進行紅外光譜掃描發(fā)現(xiàn)，胞外硒多糖在1 064 cm-1處有多糖的特征吸收峰。通過核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）1H NMR、13C NMR 結(jié)果顯示，Se可能取代了-OCH3上的CH3形成了Se=O和C-Se-C。

目前國內(nèi)對富硒乳酸菌硒核酸的研究較少，但對硒的賦存形態(tài)及分布有所報道。靳志強[25]對雙歧桿菌01進行富硒培養(yǎng)后，采用不同方法分離富硒菌體中的有機硒并測定其占有機硒含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌含有硒蛋白、硒多糖和硒核酸含量大小依次為50.7%～63.0%、9.62%～18.70%和0.273%～0.754%，這與富硒腸球菌中有機硒分布相似[26]。

當處于高硒濃度時，許多乳酸菌能將其轉(zhuǎn)化為硒單質(zhì)（納米硒）[13，27-29]。亞硒酸鈉濃度超過菌體適應(yīng)范圍，無機硒無法完全轉(zhuǎn)化為有機硒進而生成紅色的單質(zhì)硒，這是細胞的一種解毒反應(yīng)，又叫紅硒現(xiàn)象[27]。楊靖鵬等[30]在研究中發(fā)現(xiàn)，對保加利亞乳桿菌WY10富硒后，菌體在亞硒酸鈉濃度≥80 μg/mL時呈現(xiàn)為紅色，并經(jīng)顯微觀察菌體細胞周圍及表面出現(xiàn)顆粒狀的納米硒。王翼雪[31]對植物乳桿菌富硒后得到直徑為（192.28± 26.34）nm 的球狀納米硒。Kheradmand等[32]發(fā)現(xiàn)富硒胚芽乳桿菌將二氧化硒轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒，分布于菌體周圍形成納米微球。結(jié)合上述研究結(jié)果，乳酸菌菌體表面分布著納米硒，而菌體內(nèi)積累多種形態(tài)的有機硒，因而對于乳酸菌富硒規(guī)律及納米硒與有機硒的分布還有待進一步研究。

3 富硒乳酸菌及有機硒的生物活性

富硒乳酸菌及其有機硒具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤、提高免疫力、延緩衰老、促進生長等多種生物活性，具體生物活性見表2。

表2 富硒乳酸菌的生物活性Table 2 Biological activities of selenium-enriched lactic acid bacteria

3.1 抗氧化活性

硒在細胞內(nèi)通過谷胱甘肽過氧化物酶發(fā)揮抗氧化功能。Khan等[39]通過動物試驗發(fā)現(xiàn)口服富硒益生菌制劑（嗜酸乳桿菌和釀酒酵母）能夠降低丙二醛含量，升高谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性。通過體外抗氧化試驗發(fā)現(xiàn)動物雙歧桿菌01硒蛋白清除羥基、DPPH自由基的活性明顯高于其蛋白（P<0.05）。乳酸乳球菌富硒培養(yǎng)后產(chǎn)生的硒多糖對羥自由基和超氧陰離子的清除率比多糖提高約20%，且提高谷胱甘肽過氧化物酶活性[40-41]。這些研究證實了硒與某些有機物結(jié)合后能增強其抗氧化活性。

3.2 抗菌活性

一些病原微生物如大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌會引起多種疾病，而濫用抗生素會導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性[42]。Zamare等[43]發(fā)現(xiàn)不同的乳酸桿菌經(jīng)富硒培養(yǎng)后得到的硒納米，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色念珠菌的抑菌活性隨著硒納米濃度的增加而逐漸增強。以接種致病性大腸桿菌的小鼠進行富硒嗜酸乳桿菌試驗，與對照組、益生菌、亞硒酸鈉進行比較，攝入富硒嗜酸乳桿菌的小鼠死亡率僅為18.75%，低于其它組死亡率43.36%～50.00%；而采用體外混合培養(yǎng)方式的結(jié)果表明了與富硒嗜酸乳桿菌共培養(yǎng)時大腸桿菌的數(shù)量大幅度減少[44]。此外，Kheradmand等[32]發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum和L.johnsonii）富硒發(fā)酵液能抑制白色念珠菌的生長，并能將二氧化硒還原成菌體中納米硒，與非富硒菌體相比，納米硒菌體明顯減少了白色念珠菌的數(shù)量。總之，乳酸菌富硒產(chǎn)物以及菌體均能發(fā)揮抑菌作用。

3.3 抗癌活性

富硒乳酸菌通過增強巨噬細胞的功能活性，提高谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，抑制腫瘤壞死因子的釋放，防止肝細胞Ca2+濃度急劇升高，從而顯著降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷[45]。給小鼠口服硒納米（selenium nanoparticle，SeNP）的短乳桿菌后，小鼠的腫瘤生長受到抑制，干擾素-γ和白細胞介素-17水平明顯高于對照組（P≤0.05），自然殺傷細胞活性得到極顯著提高（P≤0.001）[46]。乳酸菌富硒培養(yǎng)產(chǎn)生的胞外硒多糖（enriched-selenium exopolysaccharide，Se-EPS）能增強刺激巨噬細胞的能力，發(fā)揮免疫作用；其與胃癌細胞受體結(jié)合后可使細胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸降低，說明了Se-EPS可引起腫瘤細胞發(fā)生凋亡，具有顯著的抗癌活性[47]。

4 展望

許多乳酸菌具有富集硒的能力，并能將無機硒轉(zhuǎn)化為小分子和大分子的有機硒。而乳酸菌富硒能力與亞硒酸鈉濃度、接種量、pH值等多種環(huán)境因素有關(guān)。乳酸菌遺傳特性決定著生理特性，可通過基因工程技術(shù)將腺苷三磷酸硫酸化酶（adenosine-triphosphate sulfurylase，ATPS）、谷氨酰胺半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，ECS）等基因?qū)刖w中，參與有機硒的轉(zhuǎn)化，以此來提高乳酸菌的富硒能力。乳酸菌能將生存環(huán)境下的硒轉(zhuǎn)化成不同硒化合物，硒蛋白的合成與硒代半胱氨酸合酶、硒半胱氨酸特異性延長因子、硒代磷酸鹽合成酶等基因表達有關(guān)，可以通過檢測這幾種基因的表達量來間接預(yù)測不同乳酸菌合成硒蛋白的能力。在較高濃度的硒溶液中，許多乳酸菌能將硒轉(zhuǎn)化為納米硒。許多研究證實納米硒具有活性強、毒性低、吸收好等特點，可作為一種新型的補硒形態(tài)，而對納米硒形成的關(guān)鍵性基因、酶或蛋白質(zhì)，硒進入乳酸菌的途徑及其的轉(zhuǎn)運方式等許多內(nèi)部還原機理問題等還需不斷地研究。