侯 楠，劉 源，高 俊，王 晶

(南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院 胃腸腫瘤科，河南 南陽(yáng) 473000)

胃癌(gastric cancer，GC)是全球第五常見(jiàn)的癌，且由胃癌造成的死亡成為僅次于肺癌，為第二常見(jiàn)的癌相關(guān)死因[1]。目前，盡管在GC的治療策略方面取得了明顯進(jìn)展，但GC的預(yù)后仍不太理想[2]。GC的預(yù)后不良與GC的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此，研究影響GC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子靶點(diǎn)具有重要意義。

微RNA(microRNAs，miRNAs)是一類(lèi)短的非編碼RNA，在眾多腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。miR-141-3p是miR-200家族的成員之一，在前列腺癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等腫瘤組織中呈下調(diào)趨勢(shì)，且其發(fā)揮抑癌作用[3-5]。已有報(bào)道[6]表明，miR-141-3p能抑制GC細(xì)胞增殖，但其對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲性的影響并不清楚。因此，本研究關(guān)注miR-141-3p對(duì)GC細(xì)胞遷移與侵襲的影響，并分析其中的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系與主要試劑:人胃黏膜細(xì)胞系(GES-1)和人胃癌細(xì)胞系(AGS)(中科院昆明細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清(FBS)(Life Technologies公司)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Gibco公司)；miR-141-3p的模擬物(miR-141-3p mimic)和miRNA的陰性對(duì)照(miR-NC)(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；程序性細(xì)胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1，PDCD1)過(guò)表達(dá)的慢病毒載體(LV-PDCD1)和空載體(LV-vector)(上海漢恒生物技術(shù)有限公司)；Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen公司)；miRcute miRNA分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute miRNA RT-qPCR檢測(cè)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；BCA蛋白定量試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；熒光素酶報(bào)告基因載體、報(bào)告質(zhì)粒和雙熒光素酶試劑盒(Promega公司)；PDCD1抗體(Abcam公司)；RIPA裂解液、HRP耦合的二抗和超敏ECL發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)。

1.1.2 組織樣本：收集南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院2018年7月至2019年12月收治并接受胃癌根治術(shù)的患者的腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的癌旁非腫瘤組織(距侵潤(rùn)邊緣約2 cm組織，病理形態(tài)學(xué)正常的非腫瘤組織)，共計(jì)19例。本研究經(jīng)南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：20180412013)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將GES-1和AGS細(xì)胞分別培養(yǎng)在含有10% FBS的DMEM中，并置于保持恒溫37 ℃和含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期時(shí)，收集細(xì)胞。

按照說(shuō)明書(shū)步驟，用Lipofectamine 2000試劑分別將miR-141-3p mimic和miR-NC轉(zhuǎn)入AGS細(xì)胞。用RT-qPCR鑒定轉(zhuǎn)染效率后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)miR-141-3p表達(dá)：用miRcute miRNA分離試劑盒分別提取樣本組織、GES-1和AGS細(xì)胞的miRNAs。然后用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒對(duì)miRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。最后取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和各目的引物，用miRcute miRNA RT-qPCR檢測(cè)試劑盒在ABI 7500型RT-qPCR系統(tǒng)上進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，54 ℃ 1 min和72 ℃ 1 min)。本實(shí)驗(yàn)所用的引物序列為：miR-141-3p正向序列： 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT CGCACTGGATACGACTCCAAC-3′，miR-141-3p反向序列： 5′-GGCGCATCTTCCAGTACAGT-3′；U6正向序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6反向序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)結(jié)束后，用U6作為內(nèi)部對(duì)照，用2-ΔΔCt方法分析miR-141-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 Transwell小室法實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲：分別將已轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimic和miR-NC的AGS細(xì)胞的懸浮液(5×104個(gè)/mL，100 μL)添加到鋪有基質(zhì)膠的濾膜(檢測(cè)細(xì)胞侵襲)或未鋪基質(zhì)膠的濾膜(檢測(cè)細(xì)胞遷移)的Transwell板的上腔室中，然后將600 μL含10% FBS的DMEM添加到每個(gè)孔的下腔室中。孵育24 h后，將這些細(xì)胞用0.5%結(jié)晶紫溶液中染色30 min，并用濕棉簽除去上腔室中的細(xì)胞，隨后在顯微鏡下觀察并隨機(jī)取6個(gè)視野拍照。用Image J軟件對(duì)每個(gè)視野下的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-141-3p與PDCD1是否具有靶向關(guān)系：Targetscan(http://www.targetscan. org/)顯示，miR-141-3p與PDCD1 mRNA的3′-UTR區(qū)存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。將包含PDCD1的3′UTR的DNA片段以及點(diǎn)突變DNA片段分別克隆到熒光素酶報(bào)道載體質(zhì)粒中，然后分別將報(bào)告質(zhì)粒和miR-141-3p minic或miR-NC共轉(zhuǎn)入AGS細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶試劑盒測(cè)定螢光素酶含量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)PDCD1的蛋白表達(dá)：用RIPA緩沖液裂解細(xì)胞并提取蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)經(jīng)BCA試劑盒定量后，用等量蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳。然后通過(guò)電轉(zhuǎn)法將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉PVDF后，室溫孵育一抗(PDCD1，1∶2 000；GAPDH，1∶8 000)1.5 h，然后洗膜后，室溫孵育HRP耦合的二抗1 h。再次洗膜后，通過(guò)增強(qiáng)ECL發(fā)光試劑將目的印跡可視化并顯影至于膠片。用Image J軟件分析條帶的吸光度值，并以GAPDH為內(nèi)部對(duì)照，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 LV-PDCD1和LV-vector感染：取已轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimic的AGS細(xì)胞，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟，將LV-PDCD1和LV-vector分別感染該細(xì)胞。簡(jiǎn)言之，感染前1 d，將貼壁細(xì)胞以1×105個(gè)/孔鋪到24孔板中，次日，用含6 μg/mL聚凝胺的2 mL新鮮培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。并分別取轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimic+LV-PDCD1、LV-PDCD1+LV-vector或miR-141-3p mimic的細(xì)胞，用Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-141-3p在GC組織和GC細(xì)胞中低表達(dá)

miR-141-3p在GC組織中的表達(dá)顯著低于癌旁非腫瘤組織(P<0.001)，其在AGS細(xì)胞中的表達(dá)也顯著低于GES-1細(xì)胞(P<0.001)(圖1)。

A.expression level of miR-141-3p in the non-tumor and tumor tissues (n=19); B.expression level of miR-141-3p in GES-1 cells and AGS cells (n=4); *P<0.001 compared with non-tumor tissues or GES-1 cells圖1 miR-141-3p在GC組織和細(xì)胞中低表達(dá)Fig 1 Lower expression of miR-141-3p in GC tissues and GC

2.2 過(guò)表達(dá)miR-141-3p抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲

與miR-NC組比較，miR-141-3p mimic組細(xì)胞中miR-141-3p表達(dá)明顯升高(P<0.001)，遷移和侵襲明顯降低(P<0.001)(圖2)。

2.3 PDCD1是miR-141-3p的直接靶基因

PDCD1-3′UTR與miR-141-3p具有高度保守的結(jié)合位點(diǎn)；miR-141-3p mimic顯著降低了AGS細(xì)胞中野生型PDCD1的熒光素酶活性(P<0.01)，但突變體PDCD1未觀察到該結(jié)果。與miR-NC組比較，miR-141-3p mimic組細(xì)胞中PDCD1的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)(圖3)。

2.4 miR-141-3p通過(guò)靶向PDCD1來(lái)抑制AGS細(xì)胞的遷移和侵襲

與miR-141-3p mimic+LV-vector組比較，miR-141-3p mimic+LV-PDCD1組AGS細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)(圖4)。

3 討論

GC細(xì)胞的遷移與侵襲能力不僅能直接影響GC患者的轉(zhuǎn)移還能影響GC的預(yù)后。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，有眾多miRNAs能參與調(diào)控GC細(xì)胞的遷移與侵襲[7-8]。然而，miRNAs的數(shù)量眾多，依然有許多參與調(diào)控GC細(xì)胞的遷移與侵襲的miRNAs未能發(fā)現(xiàn)或充分鑒定，且已發(fā)現(xiàn)的參與調(diào)控GC細(xì)胞的遷移與侵襲的miRNAs可能在維持機(jī)體正常生理活動(dòng)中發(fā)揮重大作用[7-8]； 因此， 仍需進(jìn)一步對(duì)能影響GC細(xì)胞的遷移與侵襲的miRNAs進(jìn)行篩選和鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p在GC組織和GC細(xì)胞中低表達(dá)，而過(guò)表達(dá)miR-141-3p能抑制AGS細(xì)胞遷移與侵襲，提示，過(guò)表達(dá)miR-141-3p可能是潛在的抗GC轉(zhuǎn)移的策略。

A.after transfected of miR-141-3p mimic or miR-NC into AGS cells, the expression level of miR-141-3p were detected; B.representative images of cell migration and invasion(×200); C.cell migration and invasion count; *P<0.01,**P<0.001 compared with the miR-NC group

A.binding site of miR-141-3p and PDCD1 predicted by bioinformatics software; B.results of dual luciferase reporter gene analysis of miR-141-3p and PDCD1; C.after over-expression of miR-141-3p, the protein expression level of PDCD1 in AGS cells; *P<0.01 compared with the miR-NC group

A.representative images of cell migration and migratory cell count; B.representative images of cell invasion and invasive cell count; *P<0.01, **P<0.001 compared with the miR-NC+LV-vector group; #P<0.01 compared with the miR-141-3p mimic+LV-vector group

miRNA一般是通過(guò)與靶基因的3′-UTR區(qū)通過(guò)堿基配對(duì)模式結(jié)合，并在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。本研究采用靶基因預(yù)測(cè)軟件發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p與PDCD1 mRNA的3′-UTR區(qū)存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)。PDCD1是一種免疫球蛋白，主要在活化的CD4+/CD8+T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和髓樣細(xì)胞的表面上表達(dá)[9]。迄今越來(lái)越多的證據(jù)[10-11]表明，PDCD1在腫瘤細(xì)胞也廣泛表達(dá)，且其可有助于腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視，從而提高了腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲能力。miR-141-3p是miR-200家族成員，而miR-200家族是PDCD1潛在調(diào)節(jié)劑。許多研究[12-13]表明了miR-200家族成員和PDCD1在腫瘤和免疫細(xì)胞上的表達(dá)水平之間的相關(guān)性。因此，需進(jìn)一步研究miR-141-3p與PDCD1之間的潛在關(guān)系，本研究通過(guò)熒光素酶法表明PDCD1是miR-141-3p的靶基因，且過(guò)表達(dá)miR-141-3p能抑制PDCD1表達(dá)。已有研究[14]表明，抑制PDCD1能抑制GC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。這些結(jié)果提示，過(guò)表達(dá)miR-141-3p對(duì)AGS細(xì)胞的遷移與侵襲的抑制作用可能是通過(guò)抑制靶基因PDCD1的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。為證明這一推測(cè)，本研究進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)染LV-PDCD1觀察其對(duì)已過(guò)表達(dá)miR-141-3p的AGS細(xì)胞遷移與侵襲的影響，發(fā)現(xiàn)LV-PDCD1能幾乎逆轉(zhuǎn)過(guò)表達(dá)miR-141-3p對(duì)AGS細(xì)胞遷移與侵襲的抑制作用，這一結(jié)果充分說(shuō)明了，miR-141-3p是通過(guò)下調(diào)靶基因PDCD1來(lái)抑制AGS細(xì)胞的遷移與侵襲。

綜上所述，本研究表明上調(diào)miR-141-3p可通過(guò)抑制PDCD1表達(dá)來(lái)抑制GC細(xì)胞遷移和侵襲，這些發(fā)現(xiàn)可能為GC的治療提供新的思路。