劉世鋒 羅玉霜 劉佩琳 康信聰 王蕾伍 睿宇 劉東波

摘 要：目的：通過人體腸道微生物生態(tài)模擬系統(tǒng)（SHIME），探究黃芩提取物對人體腸道菌群中的厭氧菌菌群豐度和短鏈脂肪酸（SCFA）的影響。方法：采用體外模擬系統(tǒng)模擬人體腸道微生態(tài)。大腸模擬罐中接種人體糞便樣本，待糞便中的微生物維持穩(wěn)定后，添加黃芩提取物（3.2 g/d）連續(xù)干預(yù)7 d，使用平板計數(shù)法分析模擬系統(tǒng)中的總厭氧菌及乳酸菌的菌群豐度變化，分別使用腦心浸液培養(yǎng)基（BHI）、MRS培養(yǎng)基（MRS）接種菌液，并在厭氧箱中倒置培養(yǎng)48 h。使用氣相色譜分析黃芩提取物干預(yù)前后的腸道菌群代謝產(chǎn)物SCFA（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸和己酸）的含量變化。結(jié)果：與第6天取樣結(jié)果相比，第14天的取樣結(jié)果黃芩提取物增加了乳酸菌在內(nèi)的厭氧菌菌群豐度。SCFA中的丁酸含量顯著上升（P<0.01），而異戊酸含量顯著下降（P<0.01）。乙酸沒有顯著差異。結(jié)論：黃芩提取物可能通過改善乳酸菌及總厭氧菌的菌群豐度，提高丁酸含量，達到治療腸道疾病的功效，為中草藥黃芩提取物的體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：人體微生物生態(tài)系統(tǒng)模擬器;黃芩提取物;腸道菌群;短鏈脂肪酸

腸道菌群與宿主相互依存、共同進化，在維持機體免疫和代謝穩(wěn)態(tài)以及抵御病原體方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1]。腸道菌群組成的改變（生態(tài)失調(diào)）與肥胖、糖尿病以及心腦血管等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2]。短鏈脂肪酸（SCFA）是人體腸道菌群代謝的主要終產(chǎn)物，主要由厭氧微生物發(fā)酵難消化的碳水化合物產(chǎn)生。SCFA包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、異己酸和己酸等，其中乙酸、丙酸、丁酸占比最高，達到總SCFA的90%以上。SCFA可以降低結(jié)腸內(nèi) pH 值，提高其酸性環(huán)境從而抑制有害菌的生長;維持水電解質(zhì)平衡[3];抑制組蛋白去乙?；负图せ頖蛋白偶聯(lián)受體GPR41、GPR43和GPR109α[4]，調(diào)節(jié)腸道、神經(jīng)、內(nèi)分泌和血液等不同系統(tǒng)的功能，成為調(diào)節(jié)代謝紊亂和免疫的關(guān)鍵因子。另外，SCFA還可以通過激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）來抑制細胞因子的產(chǎn)生（如IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）[5]從而減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生;炎癥過程中，SCFA通過激活GPR43[6]，調(diào)節(jié)中性粒細胞產(chǎn)生活性氧和吞噬作用來刺激中性粒細胞遷移[7]，從而促進粘膜炎癥的修復(fù)，降低結(jié)腸病變的發(fā)生。因此，越來越多的證據(jù)支持SCFA在形成局部和外周免疫系統(tǒng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并通過炎癥途徑影響宿主的代謝。

現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，黃芩具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗抑郁等作用[8]。劉曉曦等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩水提液可以緩解腸炎小鼠的炎癥反應(yīng)來促進腸道的損傷修復(fù)。然而，目前針對人體腸道菌群的干預(yù)研究尚欠缺。人體腸道微生物生態(tài)模擬系統(tǒng)（SHIME ），是由比利時根特大學Verstraete研制出來的一套包含胃、小腸以及大腸的完整模擬消化系統(tǒng)。SHIME系統(tǒng)的設(shè)計著重于模擬結(jié)腸微生物群落，因其穩(wěn)定性好、采集樣品方便、節(jié)省時間等優(yōu)點，是研究體外胃腸道不同部位營養(yǎng)對腸道菌群組成影響的有效工具[10]。本研究應(yīng)用SHIME模擬人體胃腸道系統(tǒng)，通過使用黃芩提取物對模擬腸道微生態(tài)進行干預(yù)，對系統(tǒng)產(chǎn)出的消化液進行檢測與分析，分析黃芩水提物對腸道菌群及其代謝產(chǎn)物SCFA的影響，探究黃芩對預(yù)防與治療腸道炎癥的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 LABOROTA 4001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司;XS205十萬分之一分析天平，德國METTLER TOLEDO公司;PL403分析天平，METTLER TOLEDO;LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠;雙列六孔水浴鍋、DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司;冰箱，海爾;KQ-52008超聲波清洗器，昆山美美超聲儀器有限公司;SHIME系統(tǒng)，北京佳德精密科技有限公司;YQX-II型厭氧培養(yǎng)箱，金壇區(qū)白塔安瑞實驗儀器廠;SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;PYX-300G-B光照培養(yǎng)箱、QL-901 Vortex渦混儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;2-16R高速冷凍離心機，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司;GC-2010氣相色譜儀，日本島津公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司。

1.1.2 試劑 黃芩，購自九芝堂股份有限公司長沙店;阿拉伯半乳聚糖、木聚糖、淀粉、葡萄糖、碳酸氫鈉、酵母提取物、蛋白胨、半胱氨酸、吐溫80、氯化鈉、果膠、一水硫酸錳、七水硫酸鐵、七水硫酸鈷、七水硫酸鋅、五水硫酸銅、磷酸氫二鉀、氯化鈣、七水硫酸鎂、血紅素、對-氨基苯甲酸、氯化鈉、胃蛋白酶、36.5%濃鹽酸、氫氧化鈉、胰蛋白酶、硫酸鋁鉀、硼酸、鉬酸鈉、氯化鎳、亞硒酸鈉、生物素、泛酸鹽、煙酰胺、維生素B12、硫胺、甲萘醌、豬膽鹽、碳酸氫鈉、PBS固體粉末、無菌蒸餾水。

標準品：乙酸、丙酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、己酸、2-乙基丁酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司;正丁酸，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 黃芩的處理 稱量85 g黃芩，以10倍量的沸水提取1.5 h，分離料液與殘渣，殘渣再以8倍量的沸水繼續(xù)提取1 h，合并料液，減壓濃縮，再冷凍干燥，得黃芩提取物凍干樣品 28.45 g。

1.2.2 模擬消化方法 系統(tǒng)模擬實驗方法包括系統(tǒng)時間、速度及其他參數(shù)設(shè)定，糞便接種液制備，腸道微生態(tài)的增殖和穩(wěn)定，胃和小腸消化液、營養(yǎng)液制備，以及模擬消化步驟均借鑒于暨南大學邵鑫[11]的試驗方法。為使系統(tǒng)內(nèi)菌群增殖并達到穩(wěn)定狀態(tài)，設(shè)定周期內(nèi)的第1～6天為穩(wěn)定期，穩(wěn)定期內(nèi)每日9∶00、15∶00、21∶00 給予260 mL混合營養(yǎng)液。第7～14天為加入黃芩提取物的干預(yù)期，干預(yù)期內(nèi)9∶00的喂料需混入3.2 g黃芩提取物凍干粉，其余操作均與穩(wěn)定期相同。

1.2.3 菌種的培養(yǎng)計數(shù) 每天第1次喂食前對大腸消化液取樣，取樣的樣品分別存放于4 ℃和-80 ℃冰箱。消化液中菌群豐度采用平板菌落計數(shù)法進行菌群數(shù)量的測定，分析總厭氧菌、乳酸菌群落數(shù)量的變化。（1）菌種的培養(yǎng)：分別取同一天存儲于4 ℃冰箱的大腸消化液樣品1 mL，用無菌PBS緩沖液進行梯度稀釋?？倕捬蹙?、乳酸菌的每個稀釋度分別涂布3個平板，每皿1 mL稀釋樣品，分別做好標記。接種結(jié)束后及時分別將15～20 mL BHI、MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注到相應(yīng)標記的每個平板中。其中，總厭氧菌采用BHI瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，乳酸菌采用MRS瓊脂培養(yǎng)基計數(shù)，將總厭氧菌、乳酸菌轉(zhuǎn)移到厭氧培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)（48±2）h。（2）菌種的計數(shù)：培養(yǎng)（48±2）h后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)，計數(shù)時選取菌落數(shù)在30～300 之間的平板（SN標準要求為25～250個菌落），若有二個稀釋度均在30～300 之間時，按國家標準方法要求應(yīng)以二者比值決定，比值≤2取平均數(shù)，比值>2則取其較小數(shù)字。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算出原始樣品每毫升中的菌落數(shù)。到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于0～4 ℃處儲存，但不得超過24 h。

1.2.4 GC檢測SCFA （1）GC分析條件：DB-FATWAX UI（30 m×0.250 mm×0.25 μm）毛細管色譜柱，載氣為高純氮氣，柱流量1.5 mL/min，升溫程序為：初始溫度70 ℃，保持1 min，以15 ℃/min升至160 ℃，保持6 min，再以30 ℃/min升至210 ℃，保持5 min;進樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，分流比19∶1，進樣量0.5 μL。（2）標準品溶液制備：對8個SCFA混合標準溶液的制備，稱量乙酸20.9 mg、丙酸20.5 mg、異丁酸9.9 mg、丁酸12.0 mg、異戊酸9.5 mg、戊酸9.2 mg、己酸9.0 mg、2-乙基丁酸9.6 mg，并用含有1%甲酸水定容至10 mL，制成混合標準品母液，分別移取該母液稀釋1、2、5、10、100、500、100倍，配制成不同濃度的混標，用一次性0.45 μm水膜過膜后，在4 ℃冰箱存放備用。（3）樣品溶液制備：取穩(wěn)定期、干預(yù)期最后一天的大腸消化液2 mL至離心管中，加入1%甲酸水，渦混儀上混勻30 s，加入內(nèi)標2-乙基丁酸1 μL，混勻1 min，再以8 000 r/min離心10 min，移取上清液過0.45 μm水膜進行氣相色譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩提取物對腸道菌群豐度的影響

2.1.1 總厭氧菌數(shù)量變化 總厭氧菌數(shù)量在前6天的穩(wěn)定期內(nèi)出現(xiàn)波動，但整體仍維持相對穩(wěn)定，從第7天開始進入干預(yù)期后，總厭氧菌的數(shù)量明顯上升，從第9天開始總厭氧菌的數(shù)量基本保持穩(wěn)定，數(shù)量約為109.03～109.07CFU（圖1）。

2.1.2 乳酸菌的數(shù)量變化 穩(wěn)定期內(nèi)，乳酸菌的數(shù)量在前3天顯著上升后維持基本穩(wěn)定，從第7天進入干預(yù)期開始，乳酸菌的數(shù)量增至最大，并在維持期內(nèi)基本保持穩(wěn)定，數(shù)量約為106.78～106.90CFU（圖2）。

3 短鏈脂肪酸含量變化分析

取SHIME運行周期中穩(wěn)定期、干預(yù)期最后一天的大腸消化液，對其中的7種SCFA（乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸、己酸）含量進行檢測分析。如圖3所示，消化液中的SCFA以乙酸、丙酸、丁酸為主，占總含量的96.76%。經(jīng)黃芩提取物干預(yù)后，大腸中的丁酸含量上升了650.57%，為0.48 mg/mL;異戊酸含量下降了84.60%，為0.004 mg/mL;其余組分含量的變化不呈現(xiàn)顯著性差異。

4 討論

SHIME系統(tǒng)是基于人體體內(nèi)消化環(huán)境而建立起的人體體外消化模型，可預(yù)測食物、藥物在人體內(nèi)的消化代謝，研究和理解營養(yǎng)物質(zhì)、藥物和非營養(yǎng)化合物的變化、相互作用以及生物可及性[12]。本研究參考邵鑫[11]的試驗方法，建立胃腸道消化模擬系統(tǒng)，并參照《藥典》記錄的黃芩推薦單日攝入量，給予系統(tǒng)等當量的黃芩提取物進行混合干預(yù)，旨在探究黃芩提取物對人體胃腸道消化系統(tǒng)中厭氧菌及菌群產(chǎn)物-短鏈脂肪酸的影響。

本研究結(jié)果表明，黃芩提取物增加了大腸發(fā)酵罐中總厭氧菌及乳酸菌的豐度，并促進了丁酸的產(chǎn)生。厭氧菌包含了普拉梭菌（Faecalibacterium prausnitzii）、直腸真桿菌（Eubacterium rectale）、霍氏真桿菌（Eubacterium hallii）、布氏瘤胃球菌（Ruminococcus bromii）等菌屬，這些菌屬可產(chǎn)生大部分的丁酸[13]。丁酸鹽不僅可以抑制NF-κB，激活巨噬細胞，而且能夠抑制組蛋白去乙?；富钚裕℉DAC）[14]，產(chǎn)生抗炎作用。乳酸菌是腸道內(nèi)不同于革蘭氏陽性菌的一類細菌的統(tǒng)稱，乳酸菌可以通過分泌各種代謝產(chǎn)物及細菌素抑制腸內(nèi)腐敗菌的生長，或與腸內(nèi)致病菌群競爭消化道附著位點和營養(yǎng)等從而維持腸內(nèi)的菌群微生態(tài)平衡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，黃芩提取物干預(yù)后乳酸菌豐度顯著上升。因此，黃芩常用于治療腸道疾病可能與其增加大腸內(nèi)乳酸菌、丁酸產(chǎn)生菌的豐度，以及提高丁酸含量有關(guān)。

蛋白質(zhì)發(fā)酵可產(chǎn)生支鏈脂肪酸，如分別來自于支鏈氨基酸纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的異丁酸、2-甲基丁酸和異戊酸酯[16]。異戊酸可以通過抑制Na+/K+-ATPase9（一種維持正常神經(jīng)傳遞所必需的基礎(chǔ)電位膜的關(guān)鍵酶）[17]，減少AMPA受體中GluR2亞基的比例，進而減少Na+流入，最終導致抑郁癥的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷能通過影響AMPA受體的表達，起到抗抑郁的作用[18];前期試驗表明，黃芩苷是黃芩提取物中的主要成分，在本試驗干預(yù)期內(nèi)異戊酸產(chǎn)出量顯著降低，推測黃芩提取物可能通過抑制異戊酸的合成，進而上調(diào)AMPA受體的表達，發(fā)揮其抗抑郁作用。

本研究建立了黃芩提取物-腸道菌群-丁酸功能軸，從腸道微生物及代謝產(chǎn)物的角度闡述了中藥黃芩干預(yù)腸道生態(tài)的基本機制。未來本課題組將使用糖尿病人的腸道菌群進行下一步試驗，本研究為進一步開展黃芩提取物的人群試驗奠定基礎(chǔ)。

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