摘 要：目的：建立氣相色譜法測定山核桃油中酚類抗氧化劑的不確定度評定數(shù)學(xué)模型，分析試驗中不確定度來源。方法：樣品經(jīng)過乙酸乙酯稀釋，采用氣相色譜法測定山核桃油中BHA、BHT、TBHQ的含量，計算合成不確定度和擴(kuò)展不確定度。結(jié)果：山核桃油中BHA、BHT、TBHQ的擴(kuò)展不確定度分別為0.097、0.093 8、0.096 6 mg/kg（k=2，P=95%）。結(jié)論：影響3種抗氧化劑氣相色譜法測定的不確定度來源主要是標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和樣品定容步驟，此不確定度評定可以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：山核桃油;抗氧化劑;BHT;BHA;TBHQ;氣相色譜法

受阻酚類抗氧化劑是一種人工合成的油溶性抗氧化劑，在油脂中有良好的溶解性，能阻止或延緩食品氧化變質(zhì)，延長食品貨架期、保持食品品質(zhì)[1]。我國GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對特丁基對苯二酚（TBHQ）、二丁基羥基甲苯（BHT）和丁基羥基茴香醚（BHA）等受阻酚類抗氧化劑在油及食用油脂食品中的使用限量作出了明確的規(guī)定，限值均≤0.2 g/kg[2]。按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.32—2016《食品中9種抗氧化劑的測定》[3]中氣相色譜法檢測時，為了排除實驗室各種因素的影響，消除結(jié)果分散性，需對最后結(jié)果進(jìn)行不確定度評估。本研究參考JJF 1059.1—2012 計量技術(shù)規(guī)范[4]、CNAS-GL06《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[5]、CNAS-GL05《測量不確定度要求的實施指南》[6]中規(guī)定的方法和程序，選擇山核桃油這類不飽和脂肪酸含量較高食用油，測定BHA、 BHT、TBHQ含量并對測量結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

山核桃油，超市購買;乙酸乙酯∶環(huán)己烷（1∶1，v/v）食品中抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ混合標(biāo)準(zhǔn)品，北京壇墨質(zhì)檢，濃度為1 000 μg/mL，不確定度2%（k=2）。環(huán)己烷，分析純，北京化學(xué)試劑公司;乙酸乙酯，色譜純，美國Fisher公司。2010PLUS氣相色譜，日本島津公司;Eppendorf-5810R多功能臺式離心機(jī)，美國艾芬道夫公司;IKA MS3渦旋振蕩器、IKA RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，德國艾卡公司;Mattler ME204電子天平，瑞士梅特勒公司。

1.2 方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 配置濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)乙酸乙酯儲備液，然后分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙酸乙酯溶液稀釋至濃度為5、10、25、50、100、200 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 實測樣品 準(zhǔn)確稱取在經(jīng)分析不含上述抗氧化劑的山核桃油樣品0.5 g（精確至0.1 mg），加入200 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)液1 mL，即得實測樣品。

1.2.3 樣品前處理 提?。夯旌暇鶆虻挠椭瑯悠?，過 0.45 μm 濾膜后，準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.1 mg），用乙酸乙酯準(zhǔn)確定容至10.0 mL，混合均勻待凈化。同時做空白試驗[3]。凈化：得到的試樣經(jīng)凝膠滲透色譜裝置凈化，收集流出液蒸發(fā)濃縮至近干，用乙酸乙酯定容至2 mL，進(jìn)氣相色譜儀（GC）分析[3]。

1.2.4 儀器分析條件 GC配氫火焰離子化檢測器（FID），DB-5MS毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;載氣流速為1.2 mL/min;升溫程序：80 ℃保持1 min，以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃保持5 min;進(jìn)樣口溫度230 ℃;檢測器溫度250 ℃;進(jìn)樣體積1 μL;不分流進(jìn)樣[3]。

1.2.5 測量數(shù)學(xué)模型 測量數(shù)學(xué)模型如式（1）：

X=C×V×1 000m×1 000（1）

式（1）中，X為樣品中抗氧化劑的含量（mg/kg）;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的提取液中抗氧化劑的質(zhì)量濃度（μg/mL）;V為提取液的體積（mL）;m為樣品稱量的質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

本試驗不確定度的分析來源包括標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過程及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的擬合、樣品的稱量及前處理過程、加標(biāo)回收率等步驟。

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel1

標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度主要包括標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合步驟引入的不確定度。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度urel1（e1） 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品證書給出的混合標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)展不確定度u（xi）均為2%（k=2），認(rèn)為是矩形分布，則混合標(biāo)準(zhǔn)品的不確定度為式（2）：

urel1（e1）=u（xi）k=0.023=0.011 5（2）

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制引入的不確定度urel1（e2）混合標(biāo)準(zhǔn)品于一組10 mL容量瓶中定容，不確定度主要由10 mL容量瓶定容、移液槍的使用引入。

（1）定容引入的不確定度主要由容量允差和溫度引入。按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[7]的要求，取玻璃量器對應(yīng)的最大允許誤差，假設(shè)為矩形分布，則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中由玻璃量器引入的不確定度0.02/3=0.011 5 mL。

試驗所用玻璃量器已在20 ℃校準(zhǔn)，而實驗室的溫度在±4 ℃之間變動。該影響引起的不確定度可通過估算該溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來進(jìn)行計算。液體的體積膨脹明顯大于容量瓶的體積膨脹，液體的膨脹系數(shù)引起的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)工作液是由乙酸乙酯稀釋配制的，在20 ℃時的膨脹系數(shù)為1.38×10-3/℃，假設(shè)溫度變化為矩形分布，由此計算的不確定度，則10 mL容量瓶引起的體積變化為±（1.38×10-3×10×4）=0.055 2 mL，不確定度為0.055 2/3=0.031 9。

由此可知，定容引入的不確定度u（F）=0.011 52+0.031 92=0.033 9 mL;相對不確定度urel1（e2-1）=0.033 9 mL/10 mL=0.033 9

（2）1 000 mL移液槍的不確定度由證書確定其擴(kuò)展不確定度為0.2%（k=2），則相對不確定度urel1（e2-2）=0.0023=0.001 2。

綜上所述，配制過程各使用6次，標(biāo)準(zhǔn)系列配制過程引入的相對合成不確定度見式（3）：

urel1（e2）=6urel1（e2-1）2+6urel1（e2-2）2=0.083 1（3）

2.1.3 線性最小二乘法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel1（e3） 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測1.2.2中樣品時，用最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的質(zhì)量濃度與峰面積曲線y=bo+bx，對應(yīng)每個y測出對應(yīng)的x值，由于y的（隨機(jī)）變化性，x的賦值會產(chǎn)生誤差。標(biāo)準(zhǔn)系列每個質(zhì)量濃度測量1次，共6個質(zhì)量濃度點，線性相關(guān)系數(shù)r大于0.999，樣品山核桃油提取液測量2次，由最小二乘法擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按式（4）、（5）計算[5]，不確定度相關(guān)參數(shù)和計算結(jié)果見表1。

Sy=∑ni=1（yi-yfi）2n-2（4）

urel1（c）=Syb1p+1n+（xpred-）2∑ni=1xi-2;urel1（e3）=urel（c）xpred（5）

式（4）、（5）中，urel1（c）為待測溶液濃度C的標(biāo)準(zhǔn)不確定度;Sy為標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合標(biāo)準(zhǔn)偏差（μg/mL）;yi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上各質(zhì)量濃度點的峰面積;yfi為由回歸方程計算得到各質(zhì)量濃度點的峰面積;n為標(biāo)準(zhǔn)曲線上校準(zhǔn)數(shù)據(jù)點的數(shù)目（n=6）;xi為標(biāo)準(zhǔn)曲線上各點的質(zhì)量濃度（μg/mL）;為標(biāo)準(zhǔn)溶液的各質(zhì)量濃度點的平均值（μg/mL）;b為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;p為平行測量樣品次數(shù)（p=2）;xpred為實測樣品的平均質(zhì)量濃度（μg/mL）;下標(biāo)i表示第幾個標(biāo)準(zhǔn)溶液。

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度，按照式（6）分別合成山核桃油中各抗氧化劑的標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，則urel1-BHA值為0.090 3;urel1-BHT值為0.087 1;urel1-TBHQ值為0.090 0。

urel1-BHA=urel1（e1）2+urel1（e2）2+urel1（e3）2=0.090 3（6）

2.2 樣品前處理過程引入的不確定度urel2

樣品前處理過程引入的不確定度主要包括樣品稱量過程、樣品定容過程、加標(biāo)回收率引入的不確定度。

2.2.1 樣品稱量過程引入的不確定度urel2（e1） 根據(jù)天平的檢定證書可知其最大允許差為±0.000 1 g，稱量樣品平均值為0.5 g，假設(shè)為矩形分布，則天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度為0.000 1/3=0.000 058 g，相對不確定度urel2（e1）=0.000 058/0.5=0.000 030。

2.2.2 樣品定容引入的不確定度urel2（e2） 試驗中樣品定容10 mL，不確定度主要由容量瓶使用引入，假設(shè)為矩形分布，其來源主要是校準(zhǔn)和溫度引入，不確定度評定過程同2.1.2（1）。相對不確定度urel2（e2）為0.033 9。

2.2.3 加標(biāo)回收率引入的不確定度urel2（e3） 回收率引入的相對不確定度屬于A類不確定度評定范疇，通常采用貝塞爾法計算[8-9]。在經(jīng)分析不含上述抗氧化劑的山核桃油中進(jìn)行添加水平為25 mg/kg的加標(biāo)回收試驗，共6個平行樣品（n=6），由回收率引入的相對不確定度見式（7），平均回收率（）、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）及不確定評定結(jié)果見表2。

s（）=SDn; urel2（e3）=s（）（7）

綜上所述，由式（8）合成由樣品前處理過程引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，則urel2-BHA值為0.036 5;urel2-BHT值為0.034 8;urel2-TBHQ值為0.035 2。

urel2=urel2（e1）2+urel2（e2）2+urel2（e3）2=0.036 5（8）

2.3 結(jié)果分析

以上各不確定度分量互不相關(guān)，由各分量 urel1（e1）、urel1（e2）、urel1（e3）、urel2（e1）、urel2（e2）、urel2（e3）可知，對抗氧化劑測定的不確定度評定影響最大的因素是標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制引入的不確定度urel1（e2），其次是標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel1（e3）和樣品定容引入的不確定度urel2（e2），其他3項對試驗結(jié)果影響不大。合成相對不確定度urel為式（9）：

urel=urel12+urel22（9）

按照式（9）得到：urel-BHA=0.097、urel-BHT=0.093 8、urel-TBHQ=0.096 6，擴(kuò)展不確定度為u（X）=2×urel（擴(kuò)展因子k=2時，對應(yīng)的置信概率為95%）。當(dāng)檢測1.2.2中的樣品時，氣相色譜法測定山核桃油中抗氧化劑結(jié)果表示為：WBHA=（338±0.097）mg/kg、WBHT=（362±0.093 8）mg/kg、WTBHQ=（344±0.096 6）mg/kg。

3 結(jié)論

本研究對氣相色譜法測定山核桃油中酚類抗氧化劑的結(jié)果進(jìn)行了不確定度評定，結(jié)果表明，不確定度最主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制步驟，其次為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合和樣品定容步驟，其他分量在實際工作中可忽略不計。選用GB 5009.32—2016第四法氣相色譜檢測酚類抗氧化劑較為可靠，分析過程中的主要不確定度來源清晰，在今后的試驗中，測量結(jié)果的不確定度評定可以只考慮其主要來源，這極大地精煉了不確定度評價過程。另外，為提高結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)主要控制以下兩點：（1）嚴(yán)格控制實驗環(huán)境，減小環(huán)境差異，使用檢定合格的定量容器及移液槍，減小標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配制與樣品定容步驟引入的不確定度。（2）選擇適中的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，使待測樣品的濃度在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間，xpred-值趨于最小;并且增加被測物的平行測量次數(shù)，使p值變大，進(jìn)一步減小標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合步驟引入的不確定度。

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Uncertainty Valuation on Determination of Phenolic Antioxidants in Pecan Oil by GC

MA Yan

（National Institute for Nutrition and Health，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China）

Abstract：Objective A mathematical model was established to evaluate the uncertainty of determination of phenolic antioxidants in pecan oil by gas chromatography，the sources of uncertainty was analyzed.Method The samples were diluted with ethyl acetate，and the BHA，BHT and TBHQ in pecan oil was determined by gas chromatography.Result The expanded uncertainties of BHA，BHT and TBHQ in pecan oil were 0.097 mg/kg，0.093 8 mg/kg and 0.096 6 mg/kg，respectively（k=2，P=95%）.Conclusion The main sources of uncertainty affecting the determination of three kinds of antioxidants by gas chromatography are the preparation of standard curve solution，the fitting of standard curve and the determination of sample volume.The evaluation of uncertainty can improve the accuracy of the test results.

Keywords：pecan oil;antioxidant;BHT;BHA;TBHQ;gas chromatography

作者簡介：馬妍（1983— ），女，碩士，副研究員，研究方向：營養(yǎng)與食品衛(wèi)生。