呼格吉樂(lè)圖

摘要：生物酶是一種具有專一性、特異性以及催化效率高的綠色催化劑。將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)之中不僅可以極大的提升工業(yè)生產(chǎn)效率而且可以有效避免環(huán)境污染，提高企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。但是生物酶對(duì)使用環(huán)境的要求較高，因此如何實(shí)現(xiàn)低成本、高效率的應(yīng)用生物酶是工業(yè)催化研究的熱點(diǎn)之一。本文對(duì)生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)進(jìn)行研究，以探討生物酶的工業(yè)化應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：生物酶;催化作用;不飽和脂肪酸;硝化反應(yīng)

1.生物催化硝化反應(yīng)

相比于化學(xué)催化作用，生物酶催化作用具有專一性、特異性以及高效性的特點(diǎn)，且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此，隨著生物科學(xué)研究的進(jìn)步，在工業(yè)化學(xué)合成領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。由于發(fā)現(xiàn)3-NT蛋的硝化產(chǎn)物存在于人和動(dòng)物的患病組織中，并且證明其中一些與過(guò)氧化物酶有關(guān)，這引起了人們對(duì)生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)的研究，過(guò)氧化物酶是一種氧化還原酶，廣泛存在于生物體中，其主要是使用過(guò)氧化氫作為電子受體來(lái)催化底物的氧化的生物酶，并通過(guò)血紅素作為次要基礎(chǔ)來(lái)參與體內(nèi)細(xì)胞的代謝。隨著生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)研究的深入，過(guò)氧化物酶在環(huán)境、臨床、食品加工和分析化學(xué)行業(yè)中起著越來(lái)越重要的作用。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)過(guò)氧化物酶可以催化可以在溫和條件下以高收率和高選擇性催化生產(chǎn)硝基苯酚類物質(zhì)。因此，過(guò)氧化物酶催化的硝化反應(yīng)的不斷深入研究和使用無(wú)疑將在未來(lái)生物學(xué)和化學(xué)相關(guān)領(lǐng)域取得重要進(jìn)展。

2.酶在納米級(jí)的固定化

酶的固定化是工業(yè)應(yīng)用中高效利用酶的必要方式，其主要指的是通過(guò)特定方法將水溶性酶轉(zhuǎn)化為不溶與水且以固態(tài)形式存在的活性物質(zhì)。相比于生物體內(nèi)的游離酶而言，酶的固定化優(yōu)勢(shì)很大，不僅可以方便與底物產(chǎn)物相互分離實(shí)現(xiàn)生物酶的回收利用，降低生物酶的使用成本，而且可以提高對(duì)催化反應(yīng)進(jìn)程的控制，保證催化反應(yīng)的穩(wěn)定進(jìn)行。在酶的固定化中，固定化載體材料是基礎(chǔ)，對(duì)于酶的各類性能影響較大，因此是酶的固定化研究的重點(diǎn)。隨著納米科學(xué)的進(jìn)展，當(dāng)前，用于固定化酶的載體材料已開始從最早的天然聚合物材料發(fā)展為合成聚合物材料，無(wú)機(jī)材料和復(fù)合材料。

3.生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)

3.1硝基不飽和脂肪酸及其生理意義

不飽和脂肪酸是之所以被稱為不飽和脂肪酸是因?yàn)榫哂刑茧p鍵結(jié)構(gòu)，根據(jù)碳雙鍵結(jié)構(gòu)的數(shù)量分為單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸。油酸（十八碳-順-9-烯酸）是典型的單不飽和脂肪酸，又稱紅油，在室溫下為無(wú)色，無(wú)味，高粘度液體，不溶于水，溶于乙醇、氯仿、乙醚、苯等有機(jī)溶劑。

硝基油酸是通過(guò)硝化反應(yīng)改性的生物活性物質(zhì)，其中碳雙鍵上的一個(gè)氫被硝基取代，并且烴鏈中的雙鍵不被破壞，因此被稱為硝基不飽和脂肪酸。對(duì)人體血漿和尿液的分析表明，人體富含硝基不飽和脂肪酸，其中，硝基油酸含量最高，研究最廣泛。硝基不飽和脂肪酸的生理作用主要體現(xiàn)在以下三個(gè)方面：（1）硝基不飽和脂肪酸可以強(qiáng)烈激活被過(guò)氧化物酶增殖劑激活的γ受體（在非常低的生理濃度下可以激活），但對(duì)PPARβ和PPARβ的作用稍弱（激活需要300nM）。（2）硝基不飽和脂肪酸在體內(nèi)也起NO供體的作用，在疏水環(huán)境中穩(wěn)定，但在極性環(huán)境中會(huì)分解和釋放NO。（3）硝基不飽和脂肪酸可用作細(xì)胞信號(hào)傳遞的介體并表現(xiàn)出親電特性，利用烷基化NF-KB蛋白質(zhì)家族p65亞基的，防止其滲透到核中并促進(jìn)相關(guān)炎癥基因的結(jié)合，參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)，抑制腫瘤壞死因子和脂多糖誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子在巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的分泌，從而發(fā)揮一定的抗炎作用。此外，硝基不飽和脂肪酸還顯示出強(qiáng)大的Nrf2/Keap1活化作用。

3.2硝基不飽和脂肪酸的化學(xué)合成

硝基不飽和脂肪酸廣泛存在于生物體內(nèi)，沒(méi)有任何毒副作用，且生物活性非常高。如果可以通過(guò)一定的方式在體外快速有效地合成，則可以極大的促進(jìn)其工業(yè)應(yīng)用。但是，目前關(guān)于體外合成硝基油酸及其衍生物的研究報(bào)告較少，主要包括化學(xué)合成和酶促合成兩種類型的硝基油酸，如下幾種合成方式：

（1）使用油酸作為原料與氯化汞（HgCl2），溴化苯基硒和亞硝酸鈉（NaNO2）以一定比例反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物被H2O2氧化和脫水，形成粗硝基油酸。然后使用多種分離和檢測(cè)方法獲得具有兩個(gè)位置異構(gòu)體（9-硝基和10-硝基）的純硝基油酸。該方法已申請(qǐng)美國(guó)專利，但該方法使用劇毒的合成材料，對(duì)環(huán)境有害。

（2）通過(guò)環(huán)辛烯在8步反應(yīng)中合成9-硝基-18烷-9-烯酸，然后使用壬二酸單甲酯作為起始原料在9步反應(yīng)中制備10-硝基-18烷-9-烯酸。但是，由于反應(yīng)步驟太復(fù)雜，產(chǎn)物收率很低，工業(yè)化效益不足需要進(jìn)一步研究。

（3）以油酸甲酯為原料，在酸性環(huán)境中與NaNO2反應(yīng)可以獲得四種類型的硝基烯烴化合物，因此需要分幾個(gè)階段進(jìn)行純化。

（4）以油酸為原料，使油酸、過(guò)氧化物酶（MPO），NaNO2和H2O2在磷酸鹽緩沖液中按一定比例反應(yīng)，并以規(guī)則的間隔逐滴添加定量的H2O2到混合物中。反應(yīng)后，分離并純化，得到產(chǎn)物。這種方法產(chǎn)生了較多多的含有硝基醇結(jié)構(gòu)的副產(chǎn)物。

（5）以油酸甲酯為原料，通過(guò)生物學(xué)方法過(guò)氧化物酶作為合成亞油酸甲酯的催化劑，產(chǎn)物非常純凈，幾乎沒(méi)有副產(chǎn)物，硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產(chǎn)物的形成。

3.3生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)

以大豆過(guò)氧化酶為基礎(chǔ)，利用磷酸銅納米花載體結(jié)構(gòu)固定化酶，探索生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)。結(jié)果表明，硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產(chǎn)物的形成，提高反應(yīng)效率，促進(jìn)生物酶催化不飽和脂肪酸的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

（1）通過(guò)大豆皮提取大豆過(guò)氧化物酶，并進(jìn)行提純。利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)法獲取最佳工藝條件。并通過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀和丙酮分級(jí)沉淀進(jìn)行提純。相關(guān)試驗(yàn)表明，最佳工藝條件為料液比1：8、溫度35℃、周期24h;硫酸銨分級(jí)沉淀飽和度范圍為30%-80%;丙酮分級(jí)沉淀體積倍數(shù)范圍為0.4-1.2。

（2）以（1）中提取的大豆過(guò)氧化酶為基礎(chǔ)，利用磷酸銅納米花載體結(jié)構(gòu)固定化酶。并測(cè)試酶活性，將其與游離酶活性進(jìn)行相比，發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)可以有效提高酶活性，增強(qiáng)強(qiáng)度為446%。且就可以進(jìn)行循環(huán)多次利用，試驗(yàn)表明經(jīng)過(guò)5次循環(huán)利用任具有80%的生物活性。

（3）以油酸為原料，分別以化學(xué)法和生物法合成硝酸油酸。通過(guò)紅外光譜、核磁共振和液相質(zhì)譜法對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試，以研究固定化酶的作用。結(jié)果表明硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產(chǎn)物的形成，值得繼續(xù)深入研究以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)證明，化學(xué)法和生物法都可以以油酸為原料生產(chǎn)硝基油酸，但是化學(xué)合成法的副產(chǎn)物較多，需要多次純化工藝。而硝基不飽和脂肪酸的生物催化作用可以抑制副產(chǎn)物的形成，但其研究仍需要進(jìn)一步完善。

結(jié)束語(yǔ)：

納米結(jié)構(gòu)固定化載體可以固定化酶，最大化酶活性的基礎(chǔ)上提高其利用效率，通過(guò)固定化酶應(yīng)用與生物催化可以有效促進(jìn)生物酶催化不飽和脂肪酸的硝化反應(yīng)，并將其與化學(xué)合成領(lǐng)域結(jié)合起來(lái)，促進(jìn)生物催化和化學(xué)合成相結(jié)合的進(jìn)一步發(fā)展。

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