高蔚娜 邊祥雨 金秀 王玲玲 麻玉瑩 于藝婧 蒲玲玲 郭長江

摘 要：目的：探討60 μmol/L槲皮素調節(jié)BRL大鼠肝細胞谷胱甘肽（GSH）代謝的可能機制。方法：采用MTT法測定槲皮素對BRL細胞活力的影響;采用試劑盒法檢測細胞內GSH和GSSG的含量，以及谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、肝臟谷胱甘肽 S轉移酶（GST）、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-GCL）、谷胱甘肽還原酶（GR）的活性;采用實時熒光定量PCR法檢測GSH-Px、GST、γ-GCL和GR基因mRNA的表達情況;采用ELISA法測定細胞內的Keap1、總Nrf2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK、p-JNK，以及細胞核Nrf2的蛋白水平。結果：槲皮素不影響大鼠肝細胞的活力（P>0.05）;與對照組比較，槲皮素組細胞內還原型GSH含量和GSH/GSSG比值（P<0.05）顯著降低（P<0.05），γ-GCL酶活性顯著減弱（P<0.05），GR和GSH-Px的mRNA表達顯著減少（P<0.05），Keap1和JNK蛋白水平顯著降低（P<0.05）。結論：槲皮素可減少BRL大鼠肝細胞還原型GSH的含量，這種作用主要與槲皮素抑制GSH的生成有關。

關鍵詞：槲皮素;谷胱甘肽;γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶;Keap1/Nrf2信號通路;MAPKs信號通路

槲皮素是一種類黃酮物質，也是分布最廣泛的多酚類化合物之一，主要存在于蔬菜、水果、紅酒、茶葉等食物和飲料中[1]。我國絕大多數水果和蔬菜中均含有槲皮素，尤其是水果中的山楂、冬棗、紅提、石榴等，以及蔬菜中的洋蔥、茴香、菠菜、球莖甘藍、小白菜等[2]。槲皮素對人體有許多有益的作用，如抗氧化、抗炎、免疫調節(jié)、抗2型糖尿病、預防動脈粥樣硬化等[3-7]。本課題組前期的研究顯示[8-9]，以含0.5%槲皮素的AIN93飼料飼喂大鼠，大鼠肝臟和血清中的谷胱甘肽（GSH）含量、還原型GSH與氧化型GSH（GSSG）比值顯著降低;血清中的谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性增強;肝臟谷胱甘肽 S轉移酶（GST）活性和mRNA表達顯著增強，而谷氨酰半胱氨酸連接酶（GCL）活性和mRNA表達顯著受抑，谷胱甘肽還原酶（GR）mRNA表達減少。本研究體外培養(yǎng)BRL正常大鼠肝細胞，以60μmol/L槲皮素誘導細胞內GSH含量減少，在此基礎上探討槲皮素對GSH代謝酶及相關代謝通路，如Kelch樣紅細胞衍生相關蛋白1（Keap1）/核因子E2樣因子2（Nrf2）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路的影響，為闡明槲皮素下調GSH含量的機制，以及制定槲皮素的推薦攝入量標準提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株與試劑

1.1.1 BRL細胞株 BRL 細胞株為正常大鼠肝細胞，購自中國科學院上海生命科學院。

1.1.2 試劑與試劑盒 槲皮素（純度≥99.9%），美國Sigma-Aldrich公司;胎牛血清，美國Gibco Life Technologies;高糖DEME培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司;GSH、γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-GCL）、GR、GSH-Px、GST試劑盒，南京建成生物工程研究所;TRIzol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green Master mix，瑞士羅氏公司;Keap1、總Nrf2、核Nrf2、細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p-ERK1/2、c-Jun NH2-末端激酶（JNK）、p-JNK ELISA檢測試劑盒，上海江萊生物科技有限公司;BCA蛋白試劑盒，上海生工生物工程股份有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及處理 將BRL細胞以4×105/mL的密度接種到含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，用60 μmol/L槲皮素干預4 h后，棄培養(yǎng)液后加1.25%胰酶消化細胞，1 000 r/min、5 min離心收集細胞沉淀。加入適量生理鹽水后，用超聲破碎儀（美國Sonics & Materials公司）破裂細胞，離心（4℃，10 000 r，20 min），取上清，用于GSH、γ-GCL、GR、GSH-Px、GST活性的測定。

1.2.2 細胞活力測定 槲皮素以DMSO溶解，制成濃縮液。實驗時以完全培養(yǎng)液將其稀釋，槲皮素在培養(yǎng)液中的終濃度為60 μmol/L，DMSO為0.5‰（v/v）。收集細胞沉淀，加完全培養(yǎng)基配制成細胞懸液，密度5×104/mL，將細胞懸液接種于96孔板，每孔200 μL。以MTT法測定60 μmol/L槲皮素干預4 h后細胞的活力，每組設5個復孔。參照馮建等[10]的方法進行。

1.2.3 GSH、γ-GCL、GR、GSH-Px、GST活性測定 按照南京建成生物工程研究所的試劑盒說明書進行。以uQuant 200-999超級酶標儀（美國Biotek公司）測定相應指標的吸光度值，按照公式計算GSH、GSSG的含量，以及4種酶的活性。

1.2.4 γ-GCL、GR、GSH-Px、GST mRNA表達測定 實時熒光定量PCR法（qPCR）。參照Zhang等[11]的方法進行。采用ABI實時定量PCR系統(tǒng)檢測熒光信號，以GAPDH為內參，計算4種酶基因的相對表達量。所用的引物如表1所示。

1.2.5 Keap1、總Nrf2、核Nrf2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、JNK、p-JNK蛋白水平測定 按照上海江萊生物科技有限公司ELISA檢測試劑盒說明書進行測定。繪制標準曲線，計算蛋白的表達量。

1.2.6 蛋白定量BCA法 按照上海生工生物工程股份有限公司的試劑盒操作進行測定，以uQuant 200-999超級酶標儀測定相應指標的吸光度值，按照公式計算細胞的蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計學處理

結果均以均數±標準差（±s）表示，使用SPSS 18.0 軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結果與分析

2.1 槲皮素對細胞活力的影響

對照組、60 μmol/L槲皮素和0.5‰DMSO的吸光度值分別為（1.78±0.14）、（1.70±0.12）、（1.61±0.12）。統(tǒng)計分析顯示，槲皮素和DMSO不影響細胞的活力（P>0.05）。

2.2 槲皮素對細胞內GSH、GSSG含量的影響

與對照組比較，60 μmol/L槲皮素組還原型GSH含量和GSH/GSSG比值均顯著降低（P<0.05）（表2），說明該劑量槲皮素具有減少細胞內GSH含量，降低GSH/GSSG比值的作用。

2.3 槲皮素對細胞GSH代謝酶活性和基因表達的影響

與對照組比較，槲皮素組GR和GSH-Px的mRNA表達顯著減少（P<0.05）（表3），γ-GCL酶活性顯著減弱（P<0.05）（表4），說明槲皮素能夠減少GR和GSH-Px的基因表達，抑制γ-GCL酶活性。該濃度槲皮素對γ-GCL、GST的基因表達，以及GR、GSH-Px、GST的活性影響不明顯。

2.4 槲皮素對Keap1/Nrf2信號途徑的影響

與對照組比較，60 μmol/L槲皮素組Keap1蛋白表達顯著降低（P<0.05），說明槲皮素能夠抑制Keap1的蛋白表達。槲皮素對總Nrf2和核Nrf2蛋白表達影響不明顯（表5）。

2.5 槲皮素對ERK和JNK MAPKs信號途徑的影響

與對照組比較，60 μmol/L槲皮素組JNK蛋白表達顯著減少（P<0.05），說明槲皮素抑制JNK蛋白的表達。槲皮素對p-JNK、ERK1/2、p-ERK1/2表達影響不大（表6）。

3 討論

GSH是人體內含量最豐富的抗氧化劑，也是體內氧化防御體系的主要組成成分之一[12]。在參與GSH代謝的4種酶中，GST以GSH為底物，結合外源性物質和異生化合物起到解毒的作用[13]。 GSH-Px以GSH為電子供體，催化過氧化物的還原反應[14]。在這些反應中，GSH轉變成其氧化形式GSSG。在GR的催化下，GSSG再生為GSH。γ-GCL是催化GSH合成的限速酶[15]。這4種GSH代謝酶中，GSH-Px和GST催化以GSH為底物的生物學反應，這些過程消耗GSH;GR催化GSH從GSSG再生為GSH，γ-GCL是GSH合成的關鍵酶，這兩種酶活性/表達增強有助于GSH含量增加。在本研究中，60 μmol/L槲皮素顯著降低BRL大鼠肝細胞內的GSH含量，降低GSH/GSSG比值，同時抑制GSH-Px和GR的基因表達，以及GCL酶活性，說明GSH生成減少是60 μmol/L 槲皮素降低大鼠肝細胞GSH含量的主要原因，GR的基因表達受抑制可能引起GSH再生減少。另外，我們以20 μmol/L 槲皮素干預BRL細胞24 h后，肝細胞內還原型GSH含量、GSH/GSSG比值顯著增加，GST、γ-GCL活性顯著增強，而GSH-Px活性顯著下降[10]，說明GSH合成增加而消耗減少是20 μmol/L 槲皮素增加細胞GSH含量的主要原因。兩個濃度的槲皮素都影響了γ-GCL的酶活性，高濃度抑制該酶活性，低濃度增強該酶活性。因此，不同濃度的槲皮素可能主要通過調節(jié)γ-GCL酶活性從而引起細胞內GSH含量的變化，γ-GCL酶是槲皮素發(fā)揮GSH代謝調節(jié)作用的重要靶點。

從MTT結果來看，盡管該劑量槲皮素引起了大鼠肝細胞GSH生成減少，但細胞的活力未受影響。我們對這種情況也進行了分析。研究者用含有槲皮素的飼料處理大鼠后，槲皮素及其甲基化代謝物（包括異鼠李素和檉柳黃素）廣泛分布于血漿和組織中，肝臟、腎臟和肺臟中的水平最高[16]。在前期的研究中，我們發(fā)現槲皮素大部分以其甲基化代謝產物的形式存在于血清和肝臟中[8]，還發(fā)現槲皮素在 Caco-2單層細胞模擬的跨膜轉運過程中伴隨著廣泛的代謝轉化，主要以甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化為主[17-18]。槲皮素的代謝物仍然具有抗氧化活性，不過作用要弱于槲皮素[19]。研究表明，部分的槲皮素代謝物會轉化成槲皮素從而在組織中發(fā)揮其抗氧化作用[20-21]。我們推測槲皮素在大鼠肝細胞中應該也有類似的代謝過程。槲皮素及其代謝產物所具備的抗氧化作用，在一定程度上彌補了GSH含量減少造成的肝細胞抗氧化防御體系功能減弱，維持了細胞的正常生存狀態(tài)。

槲皮素發(fā)揮抗氧化作用的一個重要途徑就是Keap1/Nrf2信號通路。在正常情況下，Keapl與Nrf2耦聯，并與肌動蛋白結合被錨定于胞漿中。當Keap1中的半胱氨酸殘基被破壞，或者蛋白激酶誘導了Nrf2的磷酸化，則Nrf2與Keap1解耦聯，那些游離的Nrf2移位到細胞核中，與小分子肌腱纖維瘤蛋白蛋白結合形成異二聚體并與抗氧化反應元件上游的啟動子區(qū)域結合，從而激活多種抗氧化、解毒酶等基因的轉錄[22-24]。因此核內Nrf2水平決定了Keap1/Nrf2途徑在激活基因表達方面是否起效。MAPKs屬于絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶家族，這類激酶與細胞的生存、死亡、增殖、分化等重要生命過程密切相關。在肝臟中，MAPKs信號途徑可以被多種應激激活，如氧化應激、炎癥等。JNK和ERK1/2蛋白是MAPKs家族的重要成員[25-26]，當這兩個蛋白分子被磷酸化后，JNK和ERK1/2信號通路被激活。其中JNK對應激起反應，而ERK1/2對增殖刺激起作用[27]。有研究認為，高濃度槲皮素可能是一種促氧化劑，生物反應過程中有可能產生自由基[28]，而一些自由基可誘導ERK1/2和JNK MAPK信號通路激活[29]。本研究發(fā)現，60 μmol/L槲皮素顯著減少Keap1和JNK蛋白表達，但對核Nrf2含量和p-JNK表達的影響不明顯，說明在本研究的實驗條件下，槲皮素僅影響Keap1和JNK的蛋白表達，而Keap1/Nrf2和JNK MAPKs通路未被激活。不過槲皮素是否通過Keap1/Nrf2和JNK MAPKs信號通路調節(jié)GSH代謝值得進一步研究。

綜上所述，在體外實驗條件下，60 μmol/L槲皮素減少BRL大鼠肝細胞細胞內的GSH含量，降低GSH/GSSG比值，抑制γ-GCL活性和GR的表達，因此槲皮素主要通過調節(jié)GSH的合成來發(fā)揮其對GSH代謝的調節(jié)作用。另外，在下一步的研究中，應調整實驗條件，如在濃度不變的情況下改變槲皮素干預的時間，并引入MAPK信號通路抑制劑，觀察槲皮素對核Nrf2、p-JNK水平的影響，并篩選更多可能與GSH代謝相關的信號通路，深入探討槲皮素對信號途徑的調節(jié)作用。

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Mechanism of Quercetin on Modulating Glutathione Metabolism in Rat Hepatocytes

GAO Wei-na，BIAN Xiang-yu，JIN Xiu，WANG Ling-ling，MA Yu-ying，YU Yi-jing，PU Ling-ling*，GUO Chang-jiang*

（Tianjin Institute of Environmental and Operational Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Academy of Military Sciences，Tianjin 300050，China）

Abstract：【Objective】 To explore possible mechanisms of quercetin（60 μmol/L）on glutathione（GSH）metabolism in BRL rat hepatocytes.【Method】 The viability of hepatocytes was measure by MTT method.Intracellular GSH and GSSG contents，as well as activities of glutathione peroxidase（GSH-Px），glutathione s-transferase（GST），γ-glutamic cysteine ligase（γ-GCL）and glutathione reductase（GR）were measured by commercial kits.Message RNA expressions of GSH-Px，GST，γ-GCL and GR genes were assayed by quantitative real-time PCR method.Protein levels of Keap1，total Nrf2，ERK1/2，phosphorylated ERK（p-ERK1/2），JNK，p-JNK，and nuclear Nrf2 were determined by ELISA method.Protein quantification was assayed by BCA method.【Result】 Quercetin had no effect on viability of rat hepatocytes（P>0.05）.Compared with control，intracelluar GSH content and GSH/GSSG ratio were decreased distinctly（P<0.05），activity of γ-GCL was weakened notably（P<0.05），mRNA expression of GR and GSH-Px was reduced remarkably（P<0.05），and protein levels of Keap1 and JNK were decreased significantly in quercetin group（P<0.05）.【Conclusion】 Quercetin reduces the content of reduced GSH in BRL rat hepatocytes，which was mainly due to the inhibition of GSH production.

Keywords：quercetin;glutathione（GSH）;γ-glutamic cysteine ligase（γ-GCL）;Keap1/Nrf2 signal transduction pathway;MAPKs signal transduction pathway

基金項目：國家自然科學基金面上項目（項目編號：81372988）。

作者簡介：高蔚娜（1977— ），女，博士，副研究員，研究方向：植物化學物的生物學活性。

共同通信作者：蒲玲玲（1979— ），女，碩士，高級實驗師，研究方向：植物化學物的生物學功能;郭長江（1963— ），男，博士，研究員，研究方向：植物化學物的生物學活性。