王銀博 孫維佳 李玉恒 凌樹寬 李英賢*

1 空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系，陜西 西安 710038

2 中國航天員科研訓(xùn)練中心航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國家重點實驗室，北京 100094

在骨骼生長發(fā)育以及不斷重塑的過程中，成骨細(xì)胞發(fā)揮重要的功能，不斷生成新的骨質(zhì)，增加骨量。成骨細(xì)胞分化及功能的異常會引起骨生成障礙、骨平衡紊亂，導(dǎo)致代謝性骨病[1-3]。成骨細(xì)胞分化及發(fā)揮功能的不同階段都需要能量參與，能量代謝的異常，會導(dǎo)致其功能的異常。同時，成骨細(xì)胞分泌的激素通過內(nèi)分泌系統(tǒng)參與機(jī)體代謝調(diào)控[4-6]。隨著研究的不斷深入，近年發(fā)現(xiàn)一些與成骨細(xì)胞能量代謝相關(guān)的骨代謝疾病[7]。本文將結(jié)合近年的研究，對成骨細(xì)胞的能量代謝及調(diào)控機(jī)制作以概述。

1 葡萄糖代謝及調(diào)控方式

葡萄糖是骨骼發(fā)育和生長的主要能量來源，并且對維持骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)定至關(guān)重要[8]。骨切片及小鼠顱骨成骨細(xì)胞培養(yǎng)研究表明，成骨細(xì)胞主要依靠葡萄糖提供能量，以乳酸為主要最終產(chǎn)物。即使在有氧條件下，三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，TCA)也僅起著較小的作用，這種代謝方式稱為有氧糖酵解(aerobic glycolysis)，即Warburg效應(yīng)[9]。成骨細(xì)胞消耗的葡萄糖中80%以上被轉(zhuǎn)化為乳酸[10-12]。進(jìn)一步研究[13]表明，與分化的成骨細(xì)胞相比，人類間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)更加依賴糖酵解來提供能量。但是，hMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，線粒體DNA的拷貝數(shù)、呼吸酶的蛋白亞基、耗氧率和細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量都有所增加，表明線粒體氧化還原功能增強(qiáng)。同樣，利用體外小鼠前成骨細(xì)胞進(jìn)行的一項研究[14]顯示，小鼠前成骨細(xì)胞也主要通過糖酵解產(chǎn)生ATP，而成骨向誘導(dǎo)分化后氧化磷酸化增加。當(dāng)成骨細(xì)胞礦化后，能量代謝又恢復(fù)到以糖酵解代謝為主[15]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化過程中氧化磷酸化作用增強(qiáng)，但是葡萄糖氧化磷酸化不是成骨細(xì)胞能量代謝的必要方式。用氧化磷酸化抑制劑處理成骨向誘導(dǎo)分化的BMSCs，與非處理組相比，處理組ATP并沒有降低，但是成骨分化受到抑制。分析發(fā)現(xiàn)，線粒體內(nèi)三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物檸檬酸進(jìn)入胞質(zhì)，在ATP檸檬酸裂解酶(ATP citrate lyase，ACLY)作用下轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，能夠使β-Catenin的乙?；饔眉盎钚栽黾?，進(jìn)而促進(jìn)成骨分化[16]。同時葡萄糖代謝產(chǎn)生的中間代謝產(chǎn)物檸檬酸鹽對于維持骨組織磷灰石納米晶體的結(jié)構(gòu)至關(guān)重要，能夠增加骨骼的穩(wěn)定性、強(qiáng)度和抗斷裂性[17-18]。

成骨細(xì)胞系基因表達(dá)篩查顯示，其穩(wěn)定地表達(dá)Glut1、Glut3和Glut4[19-20]。Glut1是原代成骨細(xì)胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，并且能夠通過抑制腺苷5’-單磷酸激酶和阻斷Runx 2的泛素化來調(diào)節(jié)Runx 2的翻譯后修飾。前成骨細(xì)胞中Glut1的選擇性敲除，抑制了體外和體內(nèi)成骨細(xì)胞的分化[21]。Mst1/2激酶是成骨細(xì)胞分化過程中葡萄糖攝取的重要調(diào)節(jié)劑，通過穩(wěn)定葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白Glut1來調(diào)節(jié)葡萄糖的攝取。在缺少Mst1/2激酶的情況下，Glut1的表達(dá)會丟失，導(dǎo)致AMP依賴性蛋白激酶(AMPK)激活以及Runx2蛋白酶體降解，成骨細(xì)胞組織特異性敲除兩種Mst1/2激酶，抑制了骨形成[22]。在成骨細(xì)胞分化過程中，p53(一種抑癌基因)的下調(diào)增加了Glut1表達(dá)，使代謝途徑進(jìn)一步向糖酵解轉(zhuǎn)換[23]。Glut4也介導(dǎo)了成骨細(xì)胞胰島素刺激的葡萄糖攝取。體外成骨細(xì)胞中Glut4的敲低抑制了胰島素刺激的葡萄糖攝取，減少了成骨細(xì)胞的增殖以及成熟成骨細(xì)胞的數(shù)量。但是體內(nèi)特異性敲除成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中的Glut4，小鼠骨表型正常[24]。Glut3在成骨細(xì)胞中的相關(guān)研究尚未見報道。

參與成骨細(xì)胞糖酵解的調(diào)控除了葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族外，還包括缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors，HIF)、Wnt信號、甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)和Notch信號。

BMSCs、前成骨細(xì)胞以及成骨細(xì)胞以糖酵解為主的代謝方式可能與骨髓微環(huán)境中氧含量較低有關(guān)，缺氧會增加缺氧誘導(dǎo)因子及其靶基因的表達(dá)，例如Glut1、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)以及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，這對于糖酵解代謝非常重要[25]。在前成骨細(xì)胞中表達(dá)穩(wěn)定形式的HIF1α，出生后小鼠前成骨細(xì)胞中HIF1α通過使成骨細(xì)胞群的顯著擴(kuò)增，刺激了松質(zhì)骨形成。另一方面，HIF1α通過上調(diào)丙酮酸脫氫酶激酶1(pyruvate dehydrogenase kinase1，PDK1)和糖酵解關(guān)鍵酶來刺激骨骼中的糖酵解[26]。

Wnt信號是刺激小鼠和人類骨生長發(fā)育的主要調(diào)控信號[27]。Wnt信號能夠調(diào)控合成代謝功能以及成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞中糖代謝[28-29]。Wnt3a通過增加糖酵解關(guān)鍵酶的水平誘導(dǎo)糖酵解，此代謝調(diào)節(jié)通過Wnt共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low-density lipoprotein receptor-relatedprotein 5，LRP5)介導(dǎo)，并由RAC1下游的mTORC2/AKT信號傳導(dǎo)，而不依賴β-Catenin。小鼠中LRP5的缺失會降低出生后的骨量，血清乳酸水平也相應(yīng)降低。相反，LRP5的激活突變導(dǎo)致糖酵解水平增加，小鼠骨量增加[30]，Wnt3a還上調(diào)了丙酮酸脫氫酶活性的負(fù)調(diào)節(jié)劑丙酮酸脫氫酶激酶1，減少了進(jìn)入TCA的丙酮酸量。成骨細(xì)胞組織特異性Lrp5敲除的小鼠，出現(xiàn)高血糖、高胰島素血癥，并且葡萄糖耐量和胰島素敏感性降低[31]，顯示出糖代謝障礙。這些研究充分說明，Wnt信號介導(dǎo)的有氧糖酵解是骨合成代謝的基本程序。

PTH是血清鈣水平的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)骨合成代謝。PTH能夠刺激成骨細(xì)胞有氧糖酵解，增加葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)生。與Wnt信號類似，PTH增加了MC3T3-E1細(xì)胞中糖酵解酶(己糖激酶2、LDHA和PDK1)的蛋白質(zhì)水平。放射性標(biāo)記的葡萄糖實驗表明，PTH可抑制葡萄糖進(jìn)入三羧酸循環(huán)。進(jìn)一步分析其機(jī)制，有氧糖酵解的增加是繼PTH誘導(dǎo)的胰島素樣生長因子(insulin-like Growth Factor，IGF)信號之后產(chǎn)生，而IGF的代謝作用取決于mTORC2的激活。PTH功能的實現(xiàn)依賴于環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)、IGF1R和磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K)/AKT /雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體2(mammalian target of rapamyoin Complex 2，mTORC2)信號的激活。重要的是，糖酵解的藥理干擾會抑制間歇性PTH的骨合成代謝作用。說明PTH通過IGF信號刺激有氧糖酵解有助于骨合成代謝[32]。

經(jīng)典Notch信號在骨形成中起負(fù)調(diào)節(jié)作用。Notch信號對骨骼發(fā)揮作用的機(jī)制之一是抑制早期成骨細(xì)胞中的糖酵解和隨后的成骨細(xì)胞分化。Notch 2激活后，NICD(Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域)結(jié)構(gòu)域釋放，易位至細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子RBPjk和轉(zhuǎn)錄共激活因子Maml1-3(mastermind-like transcriptional coactivator)相互作用，并誘導(dǎo)尚未被識別的阻遏物的轉(zhuǎn)錄激活，進(jìn)而抑制糖酵解酶、線粒體復(fù)合體I基因的表達(dá)，導(dǎo)致線粒體呼吸作用、超氧化物產(chǎn)生和腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)活性降低[33]。在成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中，PTH能夠抑制Notch信號的傳導(dǎo)，同時增加了這兩種途徑協(xié)同影響成骨細(xì)胞代謝的可能性[34]。

2 氨基酸代謝及調(diào)控機(jī)制

膳食蛋白質(zhì)的攝入量與骨骼健康密切相關(guān)，成骨細(xì)胞表達(dá)的氨基酸受體和轉(zhuǎn)運蛋白可根據(jù)氨基酸利用率的波動來調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝[35]。顱骨和長骨外植體中谷氨酰胺的攝取和代謝活躍[36]。穩(wěn)定的同位素示蹤實驗已提供直接證據(jù)，表明在Wnt3a誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化過程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物α-酮戊二酸(a-KG)，進(jìn)一步氧化轉(zhuǎn)化為檸檬酸鹽，增加線粒體中的能量產(chǎn)生[37]。BMSCs的增殖和分化都需要谷氨酰胺代謝的參與，谷氨酸代謝異常會導(dǎo)致BMSCs增殖和分化異常，進(jìn)而影響骨平衡[38]。研究人員[39]發(fā)現(xiàn)，骨骼干細(xì)胞(skeletal stem cells, SSCs)即BMSCs，成骨向分化消耗較多的谷氨酰胺，谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)催化谷氨酰胺生成谷氨酸，谷氨酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸。α-酮戊二酸作為三羧酸循環(huán)代謝中間物，對于SSCs增殖、分化和定位非常重要。SSCs特異性敲除GLS后，骨量明顯減少。細(xì)胞培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)，含有5.5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基足以實現(xiàn)原發(fā)性顱蓋骨成骨細(xì)胞和人成骨細(xì)胞細(xì)胞系的最大增殖。但是，當(dāng)刺激細(xì)胞礦化時，葡萄糖不足以支持其能量需求。只有在細(xì)胞培養(yǎng)基中補(bǔ)充葡萄糖和谷氨酰胺后，才能在培養(yǎng)物中觀察到高水平的骨鈣素表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)，顯示了谷氨酰胺對骨礦化的重要性[40]。

Wnt信號可正向調(diào)控谷氨酰胺代謝并且促進(jìn)骨骼合成代謝[28]。在Wnt3a誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化過程中，Wnt3a刺激谷氨酰胺在TCA中的分解代謝，該反應(yīng)需要mTORC1的激活，不依賴β-Catenin。Wnt誘導(dǎo)的谷氨酰胺濃度的降低觸發(fā)了GCN2(general control nonderepressible 2)介導(dǎo)的整合應(yīng)激反應(yīng)(integrated stress response，ISR)，ISR激活了成骨細(xì)胞分化過程中促進(jìn)蛋白質(zhì)合成代謝的基因表達(dá)。在模擬人骨硬化癥的Wnt信號過度活躍的小鼠模型中，GLS的藥理抑制導(dǎo)致的谷氨酰胺分解代謝受阻或GCN2的缺失抑制了過多的骨形成[37]。該研究說明，谷氨酰胺不僅是重要的能源提供者，而且還是成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的重要調(diào)控因子。另外，雌激素相關(guān)受體α(estrogen-related receptorα, ERRα)能夠與GLS啟動子上的響應(yīng)元件結(jié)合，誘導(dǎo)GLS的轉(zhuǎn)錄。抑制ERRα/GLS通路，hMSCs成骨向分化受抑制[41]。miR-206可以直接與GLS mRNA的3'-UTR區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致GLS表達(dá)和谷氨酰胺代謝受到抑制，進(jìn)而抑制BMSCs向成骨分化[42]。

3 脂肪酸代謝及調(diào)控機(jī)制

成骨細(xì)胞可攝取脂肪酸并且通過β-氧化提供能量，脂肪酸的利用受到激素的控制。例如，維生素D刺激脂肪酸利用而胰島素減少脂肪酸利用[43]，研究[44]預(yù)測棕櫚酸酯的氧化產(chǎn)生的能量相當(dāng)于成骨細(xì)胞利用葡萄糖獲得能量的40%～80%。體外誘導(dǎo)成骨細(xì)胞進(jìn)一步骨向分化，脂肪酸氧化顯著增加，礦化的成骨細(xì)胞中脂肪酸分解代謝活性比增殖細(xì)胞高3倍。體外抑制成骨細(xì)胞脂肪酸氧化能夠抑制其礦化和生長[45-46]。正在生長發(fā)育的小鼠和大鼠膳食適當(dāng)添加不飽和脂肪酸，對成骨細(xì)胞的性能具有積極作用，能夠降低骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險[47]。左旋肉堿和硫酸脫氫表雄酮(dehydroepiandrosteronesulfate，DHEAS)能夠通過脂肪酸代謝促進(jìn)能量產(chǎn)生，其含量隨著年齡的增長而下降，體外成骨細(xì)胞培養(yǎng)，左旋肉堿單獨處理或與DHEAS聯(lián)合處理均可增加棕櫚酸的氧化，而單獨左旋肉堿或單獨DHEAS處理可增加堿性磷酸酶(a lkaline phosphatase，ALP)活性和I型膠原蛋白(collagen type I，Col1a1)水平。這表明，在體外成骨細(xì)胞中，左旋肉堿可以增加能量產(chǎn)生，左旋肉堿和DHEAS可以提高骨形成蛋白的產(chǎn)生[48]。此外，去卵巢大鼠(骨質(zhì)疏松癥模型)應(yīng)用左旋肉堿口服補(bǔ)充劑可防止骨質(zhì)流失[49]。成熟成骨細(xì)胞中的肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶2(carnitine palmityl transferase 2，Cpt2)敲除產(chǎn)生了性別差異的骨表型，雄性僅在青春期快速生長階段表現(xiàn)出小梁骨體積的短暫減少，而雌性在發(fā)育和成熟整個生命周期，骨小梁均未達(dá)到峰值體積，并且在股骨遠(yuǎn)端和L5椎骨中表現(xiàn)出骨量減少，添加外源雌激素可加劇這種缺陷[50]。高水平Omega-3脂肪酸喂養(yǎng)的年輕小鼠，表現(xiàn)出更加快速的軟骨細(xì)胞增殖和分化能力，加速軟骨生長，高水平Omega-3脂肪酸有助于形成更好的骨小梁和骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)，并且能夠增加骨量、增強(qiáng)骨硬度[51]。以上這些研究表明脂肪酸的利用是維持正常骨骼結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素之一，而且受到性激素的調(diào)節(jié)。

小鼠體內(nèi)和體外研究均表明，LRP介導(dǎo)的Wnt信號增強(qiáng)了成熟成骨細(xì)胞的脂肪酸氧化。成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞中LRP5或LRP6的特異性敲除會減少小鼠的骨量。LRP5和LRP6敲除的前成骨細(xì)胞體外分化受到損害，顱骨前成骨細(xì)胞未能分化成成熟成骨細(xì)胞，而是獲得了軟骨細(xì)胞樣表型，骨骼發(fā)育需要LRP5和LRP6的表達(dá)[52]。經(jīng)典Wnt/β-Catenin信號也參與調(diào)控成骨細(xì)胞的脂肪酸代謝[53]。體外成骨細(xì)胞實驗顯示，刺激Wnt信號增強(qiáng)了脂肪酸的分解代謝，β-Catenin的遺傳缺陷顯著降低了油酸鹽的氧化，同時減少了成骨細(xì)胞的成熟并代償性增加了糖酵解代謝。成骨細(xì)胞特異性β-Catenin 基因缺陷的小鼠呈現(xiàn)出低骨質(zhì)量表型且白色脂肪組織質(zhì)量增加、血脂異常和胰島素敏感性受損，其原因是β-Catenin基因突變體導(dǎo)致骨骼中介導(dǎo)脂肪酸β氧化的酶表達(dá)水平降低。這些結(jié)果表明，Wnt信號對脂肪酸利用的影響是通過其經(jīng)典的信號通路完成[54]。

綜合以上研究，成骨細(xì)胞能量代謝方式比較明確，以有氧糖酵解為主，葡萄糖氧化磷酸化、氨基酸代謝和脂肪酸代謝為輔，并受Wnt信號、PTH、Notch信號的影響(圖 1)。骨細(xì)胞的能量代謝方式目前尚未見報道。

圖1 成骨細(xì)胞的能量代謝及調(diào)控機(jī)制示意圖

4 展望

骨質(zhì)疏松癥的主要特征是在成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共同作用下骨量下降和骨三維結(jié)構(gòu)遭到破壞[55]。骨質(zhì)疏松性骨折導(dǎo)致老年人生活質(zhì)量下降, 是老年人常見的死亡原因之一[56]。通過對成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞能量代謝特征的研究，有望進(jìn)一步尋找可控靶點，對骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生進(jìn)行有效的干預(yù)。