曹海榮，薛曉康，李曉宇

（1.上海應(yīng)用技術(shù)大學 化學與環(huán)境工程學院，上海 201418；2.上?；ぱ芯吭河邢薰?，上海 200062）

1 引言

丙烯酰胺是一種長期接觸會導致人和動物的神經(jīng)系統(tǒng)損傷并具有潛在的遺傳和生殖毒性的物質(zhì)［1～3］，國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）1994年對丙烯酰胺的致癌性進行了評價，將丙烯酰胺列為2A類致癌物，即人類可能致癌物［4］。丙烯酰胺合成的聚合物即聚丙烯酰胺在化妝品中具有多種用途，可用作穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、結(jié)合劑、增稠劑、成膜劑、抗靜電劑和頭發(fā)定型劑等［5］。聚合反應(yīng)不完全時，化妝品中就可能殘留有丙烯酰胺。此外，面膜產(chǎn)品中丙烯酰胺還可能來源于面膜紙［6］。我國《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）將丙烯酰胺列為化妝品禁用組分，并公布了檢測方法［7］。

測量不確定度是對測量結(jié)果質(zhì)量的定量表征，其測量結(jié)果的可用性很大程度上取決于其不確定度的大?。?～12］。鄭麗敏［3］采用溴化衍生-氣相色譜法測定丙烯酰胺含量并進行不確定度評定；林金美［4］采用高效色譜法測定紡織品中丙烯酰胺含量并進行不確定度評定；陳東洋等［1］采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飲用水中丙烯酰胺含量并進行不確定度評定；Basfar A A［13］采用核磁共振技術(shù)評價N-（異丁氧基甲基）丙烯酰胺凝膠劑量測量的不確定性。

為了保證化妝品中丙烯酰胺殘留量檢測結(jié)果的科學性，本文依據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》［14］并參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015年版）中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定丙烯酰胺殘留量的相關(guān)內(nèi)容，建立數(shù)學模型，并對測定結(jié)果進行不確定度評估，為評定測量方法和結(jié)果的可靠性、準確性提供了科學依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器與試劑

實驗采用的儀器為Acquity UPLC? H-CLASS超高效液相色譜-Xevo TQD MS三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（色譜柱為Waters Acquity UPLC? BEH C18色譜柱，1.7μm×2.1 mm×50 mm，美國Waters公司）；AL204-IC分析天平（d＝0.1 mg，瑞士梅特勒公司）；AB135-S／FACT分析天平（d＝0.01 mg，瑞士梅特勒公司）；KUDOS科導超聲波清洗器（上海科導超聲儀器公司）；Simplicity超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

實驗采用的試劑為甲醇，乙腈，乙酸銨（色譜純，德國CNW Technologies公司）；丙烯酰胺標準品（純度為99.34%）、氘代丙烯酰胺標準品（純度為99.1%），其余試劑均為市售分析純或以上規(guī)格，均來自上海安譜實驗科技股份有限公司。

2.2 實驗方法

2.2.1 色譜條件

（1）色譜柱：Waters Acquity UPLC? BEH C18色譜柱（1.7μm×2.1 mm×50 mm）。

（2）流動相：甲醇（A）和0.1%體積比的甲酸水溶液（B）梯度洗脫，洗脫程序為：0～1.5 min，A為30%；1.5～2.5 min，A由30%升至90%；2.5～3.0 min，A由90%降至30%，保持2 min。

（3）流速：0.3 mL／min。

（4）進樣量：5μL。

（5）柱溫：25℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件

（1）離子源：電噴霧離子源（ESI）；

（2）檢測模式：多反應(yīng)檢測模式；

（3）干燥氣流速：900 L·h－1；

（4）干燥氣溫度：600℃；

（5）毛細管電壓：0.30 kV；

（6）錐孔流速：50 L·h－1；

（7）丙烯酰胺、氘代丙烯酰胺的質(zhì)譜采集參數(shù)，見表1。

表1 丙烯酰胺、氘代丙烯酰胺的質(zhì)譜采集參數(shù)Tab.1 The acquisition parameters of mass spectrometry of acrylamide and acrylamide-d3

2.2.3 標準儲備溶液的配制

取丙烯酰胺標準品25.00 mg（精確到0.000 1 g），置于50 mL容量瓶中，加乙腈溶液（1∶9）使溶解并定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為500 mg／L的丙烯酰胺標準儲備溶液。

2.2.4 標準曲線溶液的配制

用乙腈溶液（1∶9）稀釋配制的丙烯酰胺標準儲備溶液，制備濃度為100.0μg／L的丙烯酰胺標準溶液。分別取100.0μg／L的丙烯酰胺標準溶液50.0μL、200.0μL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、8.0 mL至6個10 mL容量瓶中，每個容量瓶再加入氘代丙烯酰胺標準儲備溶液1.0 mL，用乙腈溶液（1∶9）定容、搖勻，得到外標為0.5μg／L、2.0μg／L、10.0μg／L、20.0μg／L、50.0μg／L、80.0μg／L的標準溶液，進行超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS／MS）法分析。

2.2.5 樣品處理

取0.2 g（精確到0.000 1 g）溶液置于10 mL玻璃試管中，加濃度為100.0 mg／L的內(nèi)標溶液200μL，超聲提取30 s；然后加0.02 mol／L的醋酸銨水溶液0.15 mL，超聲提取30 s；再加2.0 mL乙腈（1∶9），超聲提取11 min；取上清液，氮氣吹干，殘渣加2 mL色譜流動相（甲醇）溶解，超聲提取6 min；經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，濾液作為待測溶液，備用。

2.2.6 樣品檢測

用UPLC-MS／MS法分析標準溶液，以丙烯酰胺峰面積與氘代丙烯酰胺峰面積之比對丙烯酰胺濃度做標準曲線。待測樣品用同樣的方法分析后，將樣品的峰面積比值代入標準曲線，計算得到待測溶液的濃度，最后計算得到樣品中丙烯酰胺的濃度。

2.3 儀器校準證書

本實驗中涉及的所有儀器均經(jīng)過蘇州市計量研究所計量并頒發(fā)校準證書。所有的計量允許誤差均從此計量證書中獲得。

2.4 數(shù)學模型

根據(jù)樣品測試方法的過程，建立樣品中丙烯酰胺殘留量測定的不確定度評估數(shù)學模型為：

式中：X為樣品中丙烯酰胺的含量，mg／kg；C為待測樣品液中丙烯酰胺的濃度，μg／L；V為樣品液定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2.5 測量不確定度的來源

結(jié)合數(shù)學模型和測試方法，對樣品中丙烯酰胺測定結(jié)果有影響的各種不確定度分量的來源進行分析，由圖1可知具體引入的不確定度來源。由于本文采用內(nèi)標法測量樣品中丙烯酰胺含量，儀器波動、內(nèi)標儲備液的配制不會引入不確定度。

圖1 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定化妝品中丙烯酰胺含量的不確定度來源Fig.1 Determination of uncertainty of acrylamide content in cosmetics by UPLC-MS／MS.

3 實驗結(jié)果

3.1 測量重復性引入的相對標準不確定度urel（X）

在空白化妝品中添加丙烯酰胺、氘代丙烯酰胺標準溶液，得到含丙烯酰胺為49.28μg／L的化妝品試樣，即陽性樣品。在相同的條件下采用相同的方法平行測定6次，測試結(jié)果如表2所示。

表2 樣品中丙烯酰胺含量X的結(jié)果表Tab.2 The content of acrylamide in the sample

測量重復性引入的標準不確定度u（X）由式（2）計算得到。

式中：n為測量次數(shù)；Xi為每次測量得到的丙烯酰胺含量；為n次測量的丙烯酰胺含量的平均值。

測量重復性引入的相對不確定度urel（X）由式（3）計算得到。

將表2中數(shù)據(jù)代入式（2）計算可得：

將u（X）計算值代入式（3）計算可得：

3.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel（m）

儀器校準證書表明天平最大允許誤差為0.000 1 g，按均勻分布，取0.200 5 g化妝品樣品引入的標準不確定度u（m）和相對標準不確定度urel（m）分別為：

3.3 樣品溶液定容引入的相對標準不確定度urel（V）

用1 000μL移液槍取甲醇將試樣定容至2 mL，僅考慮體積引入的不確定度，由溫度引入的不確定度可以忽略。

校準證書表明1 000μL移液槍的最大誤差為±1%，即0.01 mL，按均勻分布，樣品溶液定容過程中使用1次移液槍引入的標準不確定度u1（V）和相對標準不確定度u1rel（V）分別為：

定容過程需使用2次移液槍，則樣品溶液定容引入的相對標準不確定度為：

3.4 樣品溶液濃度測量引入的相對標準不確定度urel（C）

3.4.1 外標標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel（CSTD）

（1）丙烯酰胺儲備液配制產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（C1）

（a）標樣丙烯酰胺純度引入的相對標準不確定度urel（pSTD）

由標準物質(zhì)證書可知，丙烯酰胺純度引入的擴展不確定度uexp（pSTD）為0.32%，取包含因子k＝2，丙烯酰胺純度pSTD為99.34%，則由丙烯酰胺純度引入的標準不確定度u（pSTD）和相對標準不確定度urel（pSTD）分別為：

（b）標樣丙烯酰胺稱量引入的相對標準不確定度urel（mSTD）

儀器校準證書表明天平最大允許誤差為0.000 01 g，按均勻分布，稱取0.024 84 g丙烯酰胺標樣mSTD引入的標準不確定度u（mSTD）和相對標準不確定度urel（mSTD）分別為：

（c）標準丙烯酰胺儲備液定容體積引入的相對標準不確定度urel（VSTD1）

用50 mL容量瓶將丙烯酰胺試液定容至50 mL，引入的不確定度包括體積、溫度變化以及估讀誤差。

儀器校準證書表明50 mL容量瓶的最大允許誤差為0.05 mL，按均勻分布，標準丙烯酰胺儲備液定容過程中體積變化引入的不確定度u（VV，STD1）為：

校準溫度為20℃，實驗室環(huán)境溫度為（20±5）℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10－4℃－1，按均勻分布，標準丙烯酰胺儲備液定容過程中溫度變化引入的不確定度u（VT，STD1）為：

人眼觀測容量瓶刻度線引入的不確定度：人員讀數(shù)允許有0.01 ml誤差，假定其為三角分布［15～17］，則標準丙烯酰胺儲備液定容過程中估讀誤差引入的不確定度u（VR，STD1）為：

定容過程只需使用一次容量瓶，則標準丙烯酰胺儲備液定容引入的標準不確定度u（VSTD，1）和相對標準不確定度urel（VSTD，1）分別為：

則丙烯酰胺儲備液配制產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（C1）為：

（2）丙烯酰胺儲備液稀釋產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（C2）

用200μL的可調(diào)移液槍取20μL儲備液置于100 mL容量瓶中，用乙腈水溶液（1∶9）定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為98.565 1μg／L的稀釋后的丙烯酰胺儲備液標準工作溶液。該過程產(chǎn)生的不確定度主要來源于移液槍和容量瓶。

（a）由移液槍引入的不確定度

按照均勻分布處理，由移液槍引入的不確定度僅考慮體積變化。校準證書表明200μL的移液槍取20μL溶液允許的最大誤差為±4%，即8×10－4mL，按均勻分布，則丙烯酰胺儲備液稀釋過程中使用1次移液槍引入的標準不確定度u（V0.02，STD2）和相對標準不確定度urel（V0.02，STD2）分別為：

（b）由容量瓶引入的不確定度

由容量瓶引入的不確定度包括體積、溫度變化及估讀誤差。校準證書表明100 mL容量瓶的最大允許誤差為0.1 mL，按均勻分布，則丙烯酰胺儲備液稀釋過程中體積變化引入的不確定度u（V100，STD2）為：

校準溫度為20℃，實驗室環(huán)境溫度為（20±5）℃，水的體積膨脹系數(shù)為2.08×10－4℃－1，按均勻分布，則標準丙烯酰胺儲備液稀釋過程中溫度變化引入的不確定度u（VT，STD2）為：

人員讀數(shù)允許有0.01ml誤差，假定其為三角分布［15］，則人眼觀測容量瓶刻度線引入的不確定度u（VE，STD2）為：

定容過程只需使用1次容量瓶，則標準丙烯酰胺儲備液稀釋引入的標準不確定度u（V′100，STD2）和相對標準不確定度urel（V100，STD2）分別為：

則由丙烯酰胺儲備液稀釋產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（C2）為：

（3）丙烯酰胺標準系列溶液配制過程引入的不確定度urel（C3）

根據(jù)標準溶液配制過程，取50μL、200μL、1 mL、2 mL、5 mL、8 mL各1次，10 mL容量瓶定容6次。按照前述的方法計算，由丙烯酰胺標準系列溶液配制過程引入的不確定度分量詳見表3。

表3 標準系列溶液配制過程中引入的不確定度Tab.3 The uncertainty introduced by the preparation of standard series solution

校準證書表明10 mL的容量瓶的最大允許誤差為0.02 mL，按均勻分布，標準系列溶液配制過程中體積變化引入的不確定度u（V10，STD3）為：

校準溫度為20℃，實驗室環(huán)境溫度為（20±5）℃，水的體積膨脹系數(shù)2.08×10－4℃－1，按均勻分布，則標準系列溶液配制過程中溫度變化引入的不確定度u（VT，STD3）為：

人員讀數(shù)允許有0.01 mL誤差，假定為三角分布［15］，則人眼觀測容量瓶刻度線引入的不確定度u（VR，STD3）為：

標準系列溶液配制過程中需要使用6次10 mL的容量瓶，則由丙烯酰胺標準系列溶液配制過程引入的不確定度urel（C3）為：

則外標標準溶液丙烯酰胺配制引入的相對標準不確定度urel（CSTD）為：

3.4.2 標準曲線擬合引入的不確定度urel（C4）

制備6個梯度標準溶液，每個濃度測定3次，以標準溶液質(zhì)量濃度Ci為橫坐標，以標準溶液外標峰面積（A1）與內(nèi)標峰面積（A2）的比值A(chǔ)1／A2為縱坐標，用最小二乘法擬合，獲得線性回歸方程y＝a×C＋b和線性相關(guān)系數(shù)r，列于表4中。方程中a＝1.09×10－4，b＝1.43×10－4，a為擬合曲線的斜率，b為擬合曲線的截距。

表4 標準曲線數(shù)據(jù)表Tab.4 The data of Standard curve

線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)分別為：

取1份陽性樣品，進行6次重復測定，得到平均濃度為50.3μg／L，則擬合引入的標準不確定度u（C4）為：

式中：S為標準溶液峰面積殘差的標準差，按式（5）計算；a為擬合曲線的斜率；p為樣品測定總次數(shù)，p＝6；n為標準曲線溶液測定總次數(shù)，n＝18為n次標準溶液濃度的平均值，μg／L，按式（6）計算；C0，sample為陽性樣品溶液中丙烯酰胺的平均濃度，μg／L，按式（7）計算；Ci，STD為標準溶液中丙烯酰胺的測定值，μg／L。

式中：b為擬合曲線的截距；yi，STD為標準溶液的峰面積比A1／A2。

將參數(shù)代入式（5）～式（7）可分別求得：

從而得

標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（C4）為：

3.4.3 內(nèi)標標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel（CIS）

由于內(nèi)標溶液濃度不參與定量計算，所以內(nèi)標溶液配制不引入不確定度。僅考慮氘代丙烯酰胺溶液加入體積產(chǎn)生的不確定度。氘代丙烯酰胺溶液加入體積產(chǎn)生的相對標準不確定度為urel（CIS）。用1 000μL移液槍加入內(nèi)標，僅考慮體積引入的不確定度，由溫度引入的不確定度可以忽略。

校準證書表明1 000μL移液槍的最大誤差為±1%，即0.01 mL，按均勻分布，則氘代丙烯酰胺溶液使用一次移液槍引入的標準不確定度u（VIS）和相對標準不確定度urel（VIS）分別為：

用1 000μL移液槍加入內(nèi)標，需使用6次移液槍，則氘代丙烯酰胺溶液加入體積產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（CIS）為：

則樣品溶液濃度測量引入的相對標準不確定度urel（C）為：

3.5 回收率引入的相對標準不確定度urel（R）

取0.2 g化妝品樣品，加入1 mL濃度為100.0μg／L的丙烯酰胺標準液，200μL濃度為100.0 mg／L氘代丙烯酰胺標準液，定容至2mL，得到丙烯酰胺濃度為50.0μg／L的待測液，進行回收試驗。根據(jù)表5中6次添加回收率的測定結(jié)果，計算平均加標回收率與標準偏差，從而計算標準不確定度u（R）和相對標準不確定度urel（R），計算式分別為式（8）和式（9）。

式中：n為測量次數(shù)；Ri為每次測量的丙烯酰胺回收率為n次測量的丙烯酰胺回收率的平均值。

將表5中各參數(shù)代入式（8）可求得u（R）＝1.71%，從而：

表5 加標回收實驗結(jié)果Tab.5 The result of recovery experiment

3.6 相對合成標準不確定度urel（w）及合成不確定度uc（w）

UPLC-MS／MS法測定化妝品中丙烯酰胺的相對不確定度分量見表6。

表6 各分量的相對標準不確定度Tab.6 The relative standard uncertainty of each component

相對合成標準不確定度urel（w）按式（10）計算。

將表6中參數(shù)代入式（10）可得：

合成不確定度u（w）按式（11）計算。

將已知參數(shù)代入式（11）可得：

3.7 擴展不確定度U（w）及結(jié)果表示

根據(jù)JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》取95%的置信概率，包含因子k＝2，則丙烯酰胺含量的擴展不確定度U（w）為：

UPLC-MS／MS法測定化妝品中丙烯酰胺含量的不確定結(jié)果，見表7。用UPLC-MS／MS法測定化妝品中丙烯酰胺的含量為X＝0.502±0.066 mg／kg（k＝2，置信區(qū)間p＝95%）。

表7 丙烯酰胺不確定度測定結(jié)果報告Tab.7 The result of uncertainty determination of acrylamide

4 結(jié)論

通過對化妝品中丙烯酰胺含量的不確定度評定，得出樣品中丙烯酰胺的含量為（0.502±0.066）mg／kg，k＝2，置信概率P＝95%。較全面地分析了UPLC-MS／MS法測定丙烯酰胺含量全過程不確定度的來源，并計算了各不確定度分量。分析表明，樣品溶液濃度測量和回收率是合成不確定度的主要來源；在樣品溶液濃度測量過程中由標準溶液配制和標準曲線擬合引入的不確定度所占比例較大。因此，在日常檢測中可優(yōu)化溶液配制的方法、處理全過程所使用的儀器、試劑、環(huán)境都必須達到標準要求，不斷提高操作人員的熟練程度；以減小測量結(jié)果的不確定度，提高檢測結(jié)果的準確性。