范 菲，黃炯力，安 慶，崔 穎，朱 清

（1.西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054；2.西安計量技術(shù)研究院，陜西 西安 710068）

1 引言

補骨脂素為光敏化合物，在日光照射的情況下，可導(dǎo)致受照處的皮膚發(fā)生紅腫，并且增加色素；異補骨脂素在吸入、接觸皮膚以及吞食的情況下都是有害的［1，2］。文獻［3～6］中主要報道了新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的檢測方法，并未研究其測量不確定度；然而測量不確定度能夠定量表征檢測結(jié)果的質(zhì)量，很大程度上決定了其測量結(jié)果的可用性。新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素被我國化妝品安全技術(shù)規(guī)范［7］列為禁用物質(zhì)，其測定結(jié)果的準確性尤為重要，測量不確定度評定在質(zhì)量的控制方面意義重大，是日常檢驗檢測工作的重要組成部分。

本實驗參考相關(guān)文獻［8～15］，對新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的高效液相含量測定方法進行了不確定度評定，建立了數(shù)學模型，量化了各不確定度的分量，為評定檢驗檢測結(jié)果的準確性提供了科學依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

對照品：新補骨脂異黃酮（中國食品藥品檢定研究院，批號：520052-201401）；補骨脂素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110739-201617）；補骨脂二氫黃酮（中國食品藥品檢定研究院，批號：520053-201401）；異補骨脂素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110738-201715）。

安安金純橄欖油深層水嫩晶透緊膚水（佛山市安安美容保健品有限公司，批號：II05B，簡稱緊膚水）；甲醇；乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技公司）；無水乙醇（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；三蒸水（自制）；其他分析純試劑。

測試儀器：MS105型萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；BSA124S-CW 型千分之一電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）；HC-3018R高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；ULTIMATE 3000型高效液相色譜儀（Thermo Fisher Scientific）；渦旋混勻器（德國IKA）。

2.2 方法

2.2.1 制備溶液

對照品儲備溶液：精密稱重新補骨脂異黃酮對照品5.45 mg、補骨脂素對照品5.47 mg、補骨脂二氫黃酮對照品5.65 mg、異補骨脂素對照品5.36 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解稀釋到刻度，即得。

標準系列工作溶液：分別量取上述混合對照品儲備液各1 mL、5 mL、10 mL、20 mL置于100 mL量瓶中，作為②、③、④、⑤號標準溶液，加甲醇稀釋到刻度；再精密吸?、谔栆? mL，置10 mL量瓶中，得①號標準溶液，加甲醇稀釋到刻度；最終得①、②、③、④、⑤號標準系列工作溶液。

供試品溶液：精密稱取0.5 g供試品置10 mL具塞比色管中，加6 mL甲醇，渦旋使提取溶劑與試樣混勻，超聲20 min，放冷，加甲醇至刻度，轉(zhuǎn)移到10 mL具塞離心管中，離心5 min（11 000 r／min），上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，即得。

2.2.2 色譜條件

安捷倫5 TC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈（ACN）-乙酸水溶液（0.1%），進行梯度洗脫（0～2 min，30%ACN；2～12 min，30～70%ACN；12～13 min，70～90%ACN；13～15 min，90%ACN；15～16 min，90～30%ACN；16～20 min，30%ACN）；檢測波長為246 nm；流速為1.0 mL／min；柱溫箱溫度為30℃；進樣量為10μL。

3 建立數(shù)學模型與不確定度的來源

3.1 建立數(shù)學模型

根據(jù)保留時間測其峰面積，再由標準曲線計算得到待測溶液中新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的質(zhì)量濃度，由式（1）計算得到待測組分的含量（質(zhì)量比）。

式中：w為待測組分的含量（質(zhì)量比），μg／g；m為樣品稱重，g；ρ為標準工作曲線算得待測組分的質(zhì)量濃度，μg／mL；V為樣品定容體積，mL。

各組分含量的不確定度除了受式（1）中ρ、m和V的影響外，樣品處理過程中的一致性和均勻性也會對含量產(chǎn)生影響，應(yīng)該加以考慮。

3.2 確定測量不確定度的來源

通過分析數(shù)學模型，確定測量不確定的來源如下：

（1）對照品引入的不確定度：對照品稱重引入的不確定度u（mst）、玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的不確定度u（Vst）、標準工作曲線引入的不確定度u（Cst）。

（2）樣品引入的不確定度：樣品稱重引入的不確定度u（msa）、樣品定容引入的不確定度u（Vsa）、樣品重復(fù)性引入的不確定度u（c）、回收率引入的不確定度u（R）。

（3）液相色譜儀引入的不確定度u（rHPLC）。

測量模型中，由于輸入量估計值相互獨立，所以合成相對標準不確定度urel的計算公式如下：

由式（2）可推導(dǎo)出樣品的相對合成標準不確定度為：

4 量化測量不確定度分量

4.1 對照品引入的不確定度

4.1.1 對照品純度引入不確定度u（mst）

采用十萬分之一天平稱重對照品，則不確定度的分量包括天平最大示值誤差u（m1）、分辨力u（m3）（示值可讀數(shù)）、重復(fù)性u（m2）、偏載u（m4）等的影響。從對照品的證書查得新補骨脂異黃酮、補骨脂二氫黃酮、補骨脂素和異補骨脂素的純度分別為99.6%、99.4%、99.7%和99.5%，由于證書沒有給出對照品的誤差范圍，忽略不計。另外，環(huán)境溫度、重力加速度、大氣浮力均可忽略不計。經(jīng)查計量檢定證書，計算各分量的標準不確定度，見表1。

減重法存在二次稱重，因此表1中4項的合成標準不確定度為：

表1 電子天平（d＝0.01 mg）各分量的標準不確定度Tab.1 Standard uncertainty of each component for electronic balance（d＝0.01 mg）measurement mg

已知稱取新補骨脂異黃酮（N）、補骨脂素（P）、補骨脂二氫黃酮（B）和異補骨脂素（L）對照品分別為5.45 mg、5.47 mg、5.65 mg和5.36 mg，則對照品稱重引入的相對標準不確定度分別為：

4.1.2 玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的相對標準不確定度urel（Vst）

玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的不確定度由3個部分組成：容量允差u（V1）、估值誤差u（V2）、液體溫度和液體膨脹系數(shù)u（V3）。

urel（V1）：根據(jù)JJG 196—2006專用玻璃量器檢定規(guī)程，10 mL量瓶的容量允差為±0.020 mL，根據(jù)三角分布考慮，其相對標準不確定度為

urel（V2）：10 mL量瓶的估值誤差為0.05 mL，根據(jù)三角分布考慮，其相對標準不確定度為

urel（V3）：甲醇體積膨脹系數(shù)是1.2×10－3／℃，實驗室溫度在±5℃之間變動，根據(jù)均勻分布考慮，其相對標準不確定度為

綜合上述3個分量，得10 mL容量瓶引入的相對合成標準不確定度為：

同理計算出其它玻璃量器轉(zhuǎn)移引入的相對標準不確定度，見表2，最終得

表2 玻璃量器的不確定度Tab.2 Uncertainty of each volumetric glassware mL

4.1.3 擬合標準工作曲線引入的相對不確定度urel（Cst）

精密吸取標準系列工作溶液，進行測定，以峰面積和工作溶液濃度進行線性擬合，見表3。

表3 標準系列工作溶液校準結(jié)果Tab.3 Results of calibration for standard solutions

根據(jù)擬合曲線，算得樣品中新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素平均濃度C所產(chǎn)生的不確定度為：

式中：s（A）為標準系列工作溶液峰面積的標準偏差；為標準系列工作溶液平均質(zhì)量濃度，μg／mL；C為樣品溶液平均質(zhì)量濃度，μg／mL；N為平行測定的次數(shù)，N＝2；a為標準曲線斜率；n為標準系列工作溶液測定的次數(shù)，n＝2×5＝10。

將各值代入公式（4），計算得到u（C），再由公式（5）計算得到由標準曲線求得樣品濃度引入的相對標準不確定度。

4.2 被測樣品引入的不確定度

4.2.1 稱量被測樣品引入不確定度urel（msa）

使用萬分之一電子天平稱重樣品，按照4.1.2節(jié)中的過程進行計算，各分量的不確定度見表4。

減重法存在二次稱重過程，則表4中4項合成的標準不確定度為

表4 電子天平（d＝0.1 mg）各分量的標準不確定度Tab.4 Standard uncertainty of each component for electronic balance（d＝0.1 mg）measurement mg

精密稱取樣品0.525 5 g和0.515 4 g兩份樣品，則稱重引入相對標準不確定度為

4.2.2 定容被測樣品引入不確定度urel（Vsa）

根據(jù)JJG 10—2005專用玻璃量器檢定規(guī)程，10 mL比色管容量允差是±0.10 mL，按三角分布考慮，則相對標準不確定度為

充滿液體至刻度的估值誤差是0.5 mL，按三角分布考慮，其相對標準不確定度為

最終合成得到相對標準不確定度為

4.2.3 樣品重復(fù)性引入不確定度urel（c）

精密稱取樣品10 g，精密加入對照品儲備溶液4 mL，混合均勻，在重復(fù)條件下，精密稱取樣品6份，各測定2次（n＝6，N＝2）。由式（6）、式（7）計算得到相對標準不確定度，結(jié)果見表5。

表5 樣品重復(fù)性結(jié)果（n＝6）Tab.5 Repetitive test results of samples（n＝6） μg·mL－1

4.2.4 回收率引入相對不確定度urel（R）

精密稱取空白樣品6份，進行了加標回收實驗，分別測定2次（N＝2，n＝6）。由式（8）、式（9）計算得到相對標準不確定，結(jié)果見表6。

表6 回收率結(jié)果（n＝6）Tab.6 Repetitive test results of recovery（n＝6） （%）

4.3 液相色譜儀引入的不確定度urel（rHPLC）

經(jīng)查校準證書可知，液相色譜儀二極管陣列檢測器的不確定度為0.21%，按均勻分布考慮，則相對標準不確定度為

4.4 評定測量不確定度

4.4.1 相對合成標準不確定度

把各不確定分量代入式（3），計算得出相對合成標準不確定度urel（x）。

4.4.2 擴展不確定度

根據(jù)模型和重復(fù)性實驗結(jié)果，計算6份化妝品中新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的含量均值w，取包含因子k＝2（置信概率95%）。按公式（10）計算得到的液相色譜法測定化妝品中新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的擴展不確定度分別為1.65μg／g、1.82μg／g、1.66μg／g和1.61μg／g。

4.5 不確定度報告

液相色譜法測定化妝品中新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的含量分別為：

5 結(jié)論

對化妝品中4種禁用成分的不確定度分量進行了分析，結(jié)果表明7個不確定度因素均可以不同程度影響到化妝品中新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素的含量測定結(jié)果。其中標準曲線擬合為主要因素；對照品、樣品稱量及移液定容引入不確定度其次；樣品純度、回收率、重復(fù)性引入不確定度均較小?？梢圆捎迷黾酉盗袠藴嗜芤旱臉藴庶c數(shù)；定期檢定和維護實驗儀器及量器，使其保持較高的靈敏度，或者將移液定容改為天平稱量；從而降低測量不確定度。

如果樣品基質(zhì)復(fù)雜，可采用內(nèi)標法測定，從而降低基質(zhì)引入的不確定度。本次試驗對20批化妝品進行檢測，均未檢出新補骨脂異黃酮、補骨脂素、補骨脂二氫黃酮和異補骨脂素4種物質(zhì)?？疾鞓悠窌r使用加標樣品，建議在今后的工作中，配制的工作曲線的標準點的濃度應(yīng)該盡量接近被測組分的濃度，以降低標準工作曲線變動引入的不確定度。