鄭瑞生，吳銀鳳，趙云峰，王巧燕，楊貴仁，鄭宗平

（1 泉州師范學院海洋與食品學院 福建泉州 362002 2 鹽城工學院分析測試中心 江蘇鹽城 224051 3 安記食品股份有限公司 福建泉州 362000）

鮑魚是一種原始的海洋單殼軟體動物，屬腹足綱（Gastropoda）、鮑科（Haliotidae）、鮑屬（Haliotis）[1]。它也是中國傳統(tǒng)的名貴食材，位居四大海味之首。然而，鮑魚養(yǎng)殖過程容易受到外界環(huán)境中微生物的污染[2]，如果生食容易引起致病菌感染。有研究在鮮鮑魚菌群中檢測到5 種病原體：乳酸乳球菌 （Lactococcus garvieae）、耶爾森菌（Yersinia kristensenii）、腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）、華氏鏈球菌（S.warneri）和表皮葡萄球菌（S.epidermidis），在鮮鮑魚儲存過程檢測到副溶血性弧菌 （Vibrio parahemolyticus）[3]。Cai等[4]研究發(fā)現(xiàn)副溶血弧菌、希瓦氏菌（Shewanella）是九孔鮑幼蟲的主要致病菌。此外，鮑魚加工過程由于受熱不均、殺菌不徹底等因素的影響，也容易導致熟制后的鮑魚出現(xiàn)黑變、流汁、惡臭等現(xiàn)象，造成產品的腐敗變質，產品的保質期短[5-6]。有研究認為大多數(shù)腐敗食品中只有特定微生物參與腐敗過程[7]。剛加工完的食品微生物菌群中特定腐敗菌數(shù)量少，然而在貯藏過程中其生長速度較其它微生物快，并且腐敗菌活性增強[8]。對鮑魚加工過程中的微生物群進行分析可有效預防即食鮑魚的腐敗變質，減少誤食引起中毒的風險，有助于更好地指導鮑魚的加工生產。

聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳 （PCRDGGE）技術可直接檢測樣品中細菌多樣性，定性分析水產品中總菌相變化，確定微生物種類及豐度，避免傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術對難以培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物研究的局限性[9]。應用PCR-DGGE 技術對即食鮑魚加工前、后微生物種類及數(shù)量進行動態(tài)監(jiān)測，分析其菌群變化規(guī)律及殘留的特定腐敗菌，有針對性地采取控制措施，對保證即食鮑魚產品的安全性具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皺紋盤鮑（Haliotis discus hannai），單粒重約（38.2±5.4）g，購自福建泉州某鮑魚養(yǎng)殖加工場。調味料有：調和油、香油，益海嘉里食品公司；醬油、料酒，海天調味食品公司；食用鹽，閩鹽食品公司；白砂糖，太古糖業(yè)公司；味精，安記食品公司。

SK8233 土壤基因組快速抽提試劑盒、細菌16S rDNA 片段的特異引物，上海生工生物公司；DNA Ligation Kit （Mighty Mix）、Taq DNA 聚合酶、限制性內切酶Msp I、Hae Ⅲ、dNTP、10×PCR Buffer，寶生物工程（大連）有限公司；DNA 純化回收試劑盒，天根生化（北京）科技有限公司；其余試劑均為分析純級試劑。

1.2 主要儀器與設備

PCR 反應擴增儀，美國BIO-RAD 公司；SWCJ-1D 潔凈工作臺，江蘇蘇潔凈化設備廠；DK-8D型電熱恒溫水槽，太倉市科教器材廠；DYY-8 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，北京六一生物科技公司；H6-1微型電泳槽，上海精益有機玻璃制品儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)，上海山富科學儀器公司；YXJ-2 離心機，常州環(huán)宇科學儀器廠；移液器（范圍100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL），BBI 生命科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

1）即食鮑魚加工工藝流程 鮮活鮑魚→去殼、取內臟（S1）→取鮑魚腹足部分（S2）→清洗→瀝干→拌料調味→低溫腌制→高溫烘烤熟制→低溫冷卻（S3）→真空包裝→成品貯藏（S4）→貯藏期間出現(xiàn)腐敗鮑魚（S5）。

2）取樣編號及所代表樣品 S1：鮑魚內臟，即先用無菌小刀去除鮮活鮑魚的外殼，再用滅菌醫(yī)用剪刀剪取鮮活鮑魚內臟；S2：鮑魚腹足，即無菌小刀去除鮑魚內臟后的腹足部位；S3：熟制鮑魚，即經(jīng)過高溫熟制及低溫冷卻的熟制鮑魚；S4：成品鮑魚，即經(jīng)過上述完整即食鮑魚加工工藝制成的即食鮑魚產品；S5：腐敗鮑魚，即常溫貯藏過程出現(xiàn)腐敗變質的即食鮑魚產品。

1.3.2 鮑魚樣品DNA 的制備 按照土壤基因組快速抽提試劑盒（生工SK8233）的說明書提取基因組。

1.3.3 16 S rRNA V3 區(qū)擴增 所用引物為細菌16S rDNA V3 高變區(qū) F338 （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和R518（5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'），長度230 bp 左右，反應體系50 μL，ddH2O 41.25 μL，10×Buffer （含2.0 mmol/L MgCl2）5 μL，dNTP （10 mmol/L）1 μL，F(xiàn)338-GC （10 μmol/L）1 μL，R518 （10 μmol/L）1 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 0.5 μL。反應程序：94 ℃，4 min 預變性；94 ℃，0.5 min；56 ℃，1 min；72 ℃，0.5 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。取PCR 產物各3 μL，1.5%瓊脂糖凝膠電泳，1×TAE 緩沖液，120 V 穩(wěn)壓電泳30 min，成像儀拍照。

1.3.4 變性梯度凝膠電泳（DGGE） 取400 ng 各樣品的V3 區(qū)PCR 產物，采用D-Code 突變檢測系統(tǒng)對樣品進行DGGE 分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠質量分數(shù)為8%（m丙稀酰胺∶m雙丙稀酰胺=37.5∶1），變性劑質量分數(shù)范圍為30%～60%（100%的變性劑為7 mol/L 尿素和質量分數(shù)40%甲酰胺）。在60 V 電壓、60 ℃恒溫、1×TAE 條件下電泳16.0 h。電泳完畢后，用超純水沖洗膠，然后將膠放進含溴化乙錠（EB）的染液中，置于搖床上染色30 min 后在UVI 成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 DGGE 條帶回收 選取較有代表性的條帶，用潔凈的手術刀片將目標DGGE 條帶完整的切下并裝入1.5 mL 離心管中，按SK8131 試劑盒方法回收、備用。

1.3.6 PCR 擴增及產物回收 PCR 反應體系與程序同1.3.3 節(jié)，PCR 產物按SK8131 試劑盒方法進行膠回收，并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行目的片斷TA 克隆、測序。

1.3.7 鮑魚微生物多樣性及數(shù)據(jù)分析 利用DNAman 和CHROMAS 軟件將DNA 序列進行人工校對，并將所有校對后的序列方向統(tǒng)一為正向，在EZbiocloud （http：//eztaxon-e.ezbiocloud.net）進行BLAST 檢索，根據(jù)比對結果獲得序列對應的細菌種屬信息。利用MEGA X 分析軟件對DGGE 圖譜進行聚類和相似性分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用PRIMER 5 軟件進行數(shù)理統(tǒng)計及多樣性分析。計算公式如下[10]：

式中，ni——第i 種的個體數(shù)；N——所在群落的所有種的個體數(shù)之和；H——Shannon 指數(shù)；Hmax——最大Shannon 指數(shù)，大小為log2（S），S 為物種數(shù)目。

2 結果與分析

2.1 16S rDNA V3 片段的PCR 擴增

以GC-338F 和518R 為引物擴增16S rDNA序列V3 可變區(qū)、經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得約200 bp 的DNA 片段（圖1），用于DGGE分析。

圖1 PCR 擴增的16S rDNA V3 產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA V3 sequence amplified by PCR

2.2 PCR-DGGE 指紋圖譜分析

由圖2可知，即食鮑魚加工過程中各采樣點的V3 高變區(qū)序列類型較為豐富，由表1群落多樣性特征數(shù)據(jù)可知，S1 鮑魚內臟及S5 腐敗鮑魚的細菌多樣性指數(shù)相對較低，分別為2.565 和2.485；而S2、S3、S4 相對豐富，均達到2.773。均勻性指數(shù)E 均為1。而豐度指數(shù)S 變化趨勢則與多樣性指數(shù)H 基本對應，S1 與S5 豐度較低，分別為13 和12；S2、S3、S4 均為16，說明即食鮑魚加工過程受外界環(huán)境影響，可能帶入一些外界微生物，導致菌群分布較廣，而在腐敗鮑魚中，由于受到優(yōu)勢腐敗菌的影響，其它群菌的生長受到抑制。

表1 不同鮑魚樣品細菌群落特征Table 1 Characteristics of bacterial community in different abalone samples

圖2 鮑魚樣品的細菌16S rDNA-PCR 產物DGGE 圖譜Fig.2 DGGE atlas of bacterial 16Sr DNA-PCR product of abalone samples

由圖3可知，S2、S3、S4、S5 相似性較高，尤其是S2 與S3 進化樹距離最近，相似性最高，而S1樣品與其它樣品進化距離較遠。S1 樣品為鮑魚內臟，存在的細菌群落特征與鮑魚腹足部位存在一定差異。S2 到S5 相似性較高，說明加工過程鮑魚菌群構成存在一定差異，但變化不大。

圖3 不同鮑魚樣品進化樹Fig.3 Evolutionary trees of different abalone samples

2.3 DGGE 凝膠條帶回收測序及序列分析

對圖2中編號1～19 的條帶進行收回、序列克隆測序，將序列結果提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫，進行同源性比較，獲得最相似菌株的16S rDNA 序列（表2）。根據(jù)這些DGGE 帶譜所代表的微生物可判定即食鮑魚加工過程細菌群落的組成狀況。結果表明：19 個條帶與4 個菌門相似度較高，分別是疣微菌門 （Verrucomicrobia），擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）。與7 個菌綱相似度較高，分別是疣微菌綱（Verrucomicrobiae）、黃桿菌綱（Flavobacteriia）、芽胞桿菌綱（Bacilli）、噬幾丁質桿菌綱（Chitinophagia）、梭菌綱 （Clostridia）、擬桿菌綱（Bacteroidia）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）。普遍認為，16S rDNA 序列同源性大于99%，可以認為屬于同一種；大于95%可認為同一屬[11]。從比對結果可知，5 組鮑魚樣品的菌群與12 個菌屬較為相似，分別為：紅色桿菌屬（Rubritalea）、金黃桿菌屬 （Chryseobacterium）、穩(wěn)桿菌屬（Empedobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棲水菌屬（Hydrobacter）、瘤胃梭菌屬（Ruminiclostridium）、普雷沃菌屬（Prevotella）、埃希氏菌屬（Escherichia）、芽孢桿菌屬 （Bacillus）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）、沙雷氏菌屬（Serratia）及黃桿菌屬（Flavobacterium）等。根據(jù)條帶亮度可判斷不同處理鮑魚樣品優(yōu)勢菌略有不同，鮑魚內臟優(yōu)勢菌有：埃希氏菌、普雷沃菌、沙雷氏菌、穩(wěn)桿菌等。鮑魚腹足優(yōu)勢菌有：紅色桿菌、埃希氏菌、普雷沃菌、穩(wěn)桿菌、沙雷氏菌等。而到了熟制鮑魚優(yōu)勢菌變?yōu)榘ＯＪ暇?、穩(wěn)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、沙雷氏菌等。成品即食鮑魚的優(yōu)勢菌有：埃希氏菌、穩(wěn)桿菌、寡養(yǎng)單胞菌、沙雷氏菌等。腐敗的鮑魚中存在的優(yōu)勢菌為芽孢桿菌、穩(wěn)桿菌、埃希氏菌、沙雷氏菌等，尤其檢出大量蠟樣芽孢桿菌。5 組鮑魚樣品的共同優(yōu)勢菌有埃希氏菌、穩(wěn)桿菌、沙雷氏菌。而腐敗鮑魚中檢出大量的芽孢桿菌在即食鮑魚前期處理階段并非優(yōu)勢菌。

表2 DGGE 凝膠條帶回收序列分析結果Table 2 Sequence analysis results of DGGE gel bands

紅色桿菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧菌，存在于深海水產品中[12]，金黃桿菌為革蘭氏陰性、非發(fā)酵菌，多數(shù)為吲哚產生菌[13]。穩(wěn)桿菌為非發(fā)酵菌黃桿菌屬，是革蘭氏陰性、無芽胞桿菌，常存在于水、土壤和植物中[14]，也存在于食品、乳制品和蔬菜中[15]。有報道稱短穩(wěn)桿菌存在于北豆腐中可致其腐敗變質[16]。葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，多數(shù)為非致病菌，有些也會引起部分海產品感染病變。如Ali等[17]從白鯛肌肉，尾巴，眼睛和心臟血液的病變樣本中回收了15 種表皮葡萄球菌。棲水菌為兼性厭氧發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌下的弧菌科。Eder 等[18]曾從純凈水中分離出彭氏棲水菌（Hydrobacter penzbergensis gen.nov.），氧化酶和過氧化氫酶陽性細菌。普雷沃菌是常見無芽孢革蘭氏陰性厭氧桿菌，最常見的產黑普雷沃氏菌（Prevotella melaninogenica）是引起口腔化膿性疾病重要的病原體[19]。埃希氏菌是易引發(fā)人類感染的重要病原菌之一，大腸埃希氏菌（Escherichia）是水產品加工過程常見的腐敗菌及致病菌[20]，該菌不僅可通過糞便污染周圍環(huán)境，還可通過海鮮加工中廢水或下腳料等來污染食品。尤其是在加工后期，凈化級別不夠的加工環(huán)境可能引起大腸桿菌的污染，需要引起重視。Prakasan 等[21]曾從18 種魚類和21 種貝類樣品中分離出368 株大腸桿菌。Roschanski等[22]從德國零售蛤和蝦中分離出45 株腸桿菌科細菌。芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，是加工水產品常見的殘留菌之一，在腐敗的鮑魚中檢出大量蠟樣芽孢桿菌，這可能是因為芽孢桿菌具有耐高溫、耐鹽等特性，殺菌不徹底導致其在成品即食鮑魚中殘留。Osimani 等[23]分析發(fā)現(xiàn)煮熟、干燥和腌制的即食昆蟲食品中主要由產孢子的芽孢桿菌和梭狀芽胞桿菌為主。Rahmati 等[24]在347 個零售的新鮮和加工過的海鮮樣品中檢測出蠟狀芽孢桿菌，它是引起海鮮制品食源性疾病的重要菌株（特別是產生腸毒素的基因型）。高鵬等[25]研究發(fā)現(xiàn)引起肘花脹袋的微生物是芽孢桿菌 （Bacillus subtilis，Bacillus licheniformis）和寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia，Stenotrophomonas pavanii）。寡養(yǎng)單胞菌屬革蘭氏陰性細菌，嗜冷微生物，廣泛存在于水、土壤和動物體內，為條件致病菌及腐敗菌，會引起一些冷藏食品變質[26]。沙雷氏菌是革蘭氏陰性、兼性厭氧，其模式菌株-黏質沙雷氏菌會產生紅色色素。它們的新陳代謝具有發(fā)酵作用，在腐爛的動植物材料上具有腐生性[27]。Wang 等[28]研究表明黏質沙雷氏菌容易引起冷藏雞肉變質腐敗。黃桿菌屬是革蘭氏陰性桿狀細菌，在土壤和淡水中都發(fā)現(xiàn)了黃桿菌，已知個別菌種會引起淡水魚疾病[29]。

2.4 鮑魚優(yōu)勢條帶序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序所得16S rDNA 序列與核酸序列數(shù)據(jù)庫中已知序列進行比對，選取相似性高的菌株，利用MEGA 7.0 構建不同處理階段鮑魚樣品的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示它們在系統(tǒng)發(fā)育過程中的親緣關系。由圖4可知，19 個條帶檢出的相似細菌分布在4 個菌門和12 個菌屬。條帶2，3，5，7，8，9，11 和19 在親緣關系上較近，聚為一大支，即為擬桿菌門。條帶10，14，15，16，17 和18 聚為一支，表示具有較近的親緣關系，即為變形菌門。條帶4，6，12，13 在親緣關系上較近，聚為一支，即為厚壁菌門。條帶1 與其它菌在親緣關系較遠，單獨為一支，即為疣微菌門，其僅存在于鮮鮑魚中，在即食鮑魚加工中后期未再出現(xiàn)。12 個菌屬分別為：普雷沃菌屬（條帶7，8，11）、棲水菌屬（條帶5）、黃桿菌屬（條帶19）、金黃桿菌屬（條帶2）、穩(wěn)桿菌屬（條帶3 和9），寡養(yǎng)單胞菌屬（條帶15 和17），沙雷氏菌屬（條帶16 和18），埃希氏菌屬（條帶10和14），紅色桿菌屬（條帶1），瘤胃梭菌屬（條帶6），葡萄球菌屬（條帶4），芽孢桿菌屬（條帶12 和13）。厚壁菌門（條帶4，6，12，13）與其它菌親緣關系較遠，其在熟制鮑魚、成品鮑魚和腐敗鮑魚樣品中均有出現(xiàn)，說明從鮑魚加工后期帶入的可能性極大。

圖4 細菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of bacterial strains

3 結論

本研究采用PCR-DGGE 法對不同處理階段鮑魚樣品的殘留細菌菌群進行了分析，發(fā)現(xiàn)不同加工過程鮑魚細菌種類較為豐富，19 個條帶中與4 個菌門相似度較高，分別是疣微桿菌門，擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門。與12 個菌屬較為相似，分別為：普雷沃菌屬、棲水菌屬、黃桿菌屬、金黃桿菌屬、穩(wěn)桿菌屬，寡養(yǎng)單胞菌屬，沙雷氏菌屬，埃希氏菌屬，紅色桿菌屬，瘤胃梭菌屬，葡萄球菌屬和芽孢桿菌屬。

不同處理鮑魚樣品優(yōu)勢菌株略有不同，但5組鮑魚樣品的共同優(yōu)勢菌有埃希氏菌、穩(wěn)桿菌、沙雷氏菌。在腐敗鮑魚中檢出大量的蠟樣芽孢桿菌，具有較高的耐受性。因此，建議鮑魚加工過程中應嚴格控制加工后期冷卻及包裝環(huán)境，密切關注設備及環(huán)境衛(wèi)生的控制，降低芽孢桿菌、埃希氏菌、穩(wěn)桿菌、沙雷氏菌等腐敗菌對即食鮑魚的加工、運輸、保藏過程所造成的安全危害。

志謝：本論文在系統(tǒng)發(fā)育樹的構建上得到泉州師范學院黃兆斌副教授的指導，在此表示感謝！