沈 葹，耿珠峰，何 清，卓 勤*

（1 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所 國家衛(wèi)生健康委員會(huì)微量元素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100050 2 北京師范大學(xué)分析測試中心 北京 100875 3 天津大學(xué)化工學(xué)院 天津 300350）

蜂蜜為蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜物質(zhì)[1-2]。常見的蜂蜜品種是根據(jù)蜜源植物劃分，我國針對(duì)天然蜂蜜來源于1 種或2 種以上蜜源的植物花蜜劃分為單花蜜和百花蜜。不同的蜜源植物具有結(jié)構(gòu)多樣的次生代謝產(chǎn)物，其通過蜜蜂的釀造作用轉(zhuǎn)化成蜂蜜中的特征代謝產(chǎn)物，受植物源的生物合成途徑、地理氣候、儲(chǔ)存方式等多種因素的影響，可作為判別蜜源、區(qū)別不同產(chǎn)地的依據(jù)[3-4]。

溯源檢測技術(shù)在蜂蜜品種鑒定中起到重要的技術(shù)支持作用，相較傳統(tǒng)上確定蜜源植物主要運(yùn)用的感官鑒定和花粉分析法，目前新的分析技術(shù)正逐漸被應(yīng)用于蜜源鑒別，涉及的檢測技術(shù)主要有色譜分析[5]、近紅外光譜[6]、核磁共振波譜法[7]、電感耦合等離子體質(zhì)譜[8]和分子生物學(xué)[9]等。基于蜂蜜理化分析數(shù)據(jù)模式評(píng)價(jià)，通過多種溯源技術(shù)對(duì)蜂蜜化學(xué)成分進(jìn)行差異化分析，判斷植物源，正逐漸成為國內(nèi)外蜂蜜品種鑒別的熱門研究方法，我國在此領(lǐng)域的研究相對(duì)薄弱。

目前的研究強(qiáng)調(diào)特寫模式，存在標(biāo)準(zhǔn)品的瓶頸以及檢測器的局限性，對(duì)蜂蜜的全面化學(xué)信息獲取有限，缺乏對(duì)于不同單花蜜差異代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)分析。隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，植物代謝組學(xué)作為代謝組學(xué)的一個(gè)重要分支，以植物及其代謝產(chǎn)物為對(duì)象的系統(tǒng)生物學(xué)研究，被廣泛應(yīng)用于食品研究領(lǐng)域[10]。核磁共振可提供豐富的代謝物結(jié)構(gòu)信息，且具有理想的信號(hào)重現(xiàn)性與前處理簡便等特點(diǎn)，對(duì)豐度較高的代謝產(chǎn)物分析能力強(qiáng)，因此核磁共振分析已成為代謝組學(xué)的重要分析技術(shù)，運(yùn)用到多種食品摻假及鑒別分析中[11-13]，然而由于NMR 所得到的代謝組學(xué)信息復(fù)雜，因此選擇合適的數(shù)據(jù)分析方法對(duì)于從海量數(shù)據(jù)中分析差異，挖掘并提煉出各代謝物之間潛在的相關(guān)關(guān)系非常重要。目前國內(nèi)核磁共振波譜法結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法在蜂蜜蜜源差異分析和鑒別領(lǐng)域的應(yīng)用仍然較少。本研究基于植物代謝組學(xué)差異化分析的策略，優(yōu)化前處理方法并采用核磁共振波譜技術(shù)構(gòu)建洋槐蜜、荊條蜜、葵花蜜和麥盧卡蜂蜜的全景代謝物分析譜圖，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，基于不同的判別分析模型對(duì)4 種單花蜜進(jìn)行差異化分析及代謝物之間的關(guān)系研究，為不同蜜源的蜂蜜品種鑒別和品質(zhì)分析提供科學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

聯(lián)系知名品牌廠家直接采集70 個(gè)商品蜜樣品，分別為26 個(gè)洋槐蜜（產(chǎn)地：北京、陜西和山東）、19 個(gè)荊條蜜（產(chǎn)地：北京和山東）、14 個(gè)葵花蜜（產(chǎn)地：內(nèi)蒙古和甘肅）和11 個(gè)麥盧卡蜜（新西蘭），均為市場主流商品蜂蜜且價(jià)格相差大。所有的蜂蜜樣品均在4 ℃的冰箱中貯藏待用。

稱取蜂蜜約20 g，加入35 mL 10%氯化鈉水溶液加熱超聲提取，加入15 mL 1%甲酸乙腈旋渦振蕩5 min，5 000 r/min 離心5 min，取上層乙腈層，采用減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于40 ℃濃縮蒸干，用600 μL 氘代甲醇溶解，核磁上機(jī)分析。

1.2 儀器與試劑

AVANCE III 核磁共振波譜儀及Topspin 3.2軟件，德國布魯克公司；ME204 電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA 公司；高速離心機(jī)、渦旋混合器，德國Eppendorf 公司；KQ5200E 型超聲波清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司；5 mm 核磁管，美國Norell 公司；含體積分?jǐn)?shù)0.03% TMS（三甲基硅烷）的甲醇-d 4 （≥99.8 atom % D）、氯化鈉、甲酸，Sigma Aldrich 公司；乙腈（色譜純級(jí)），賽默飛世爾公司。

1.3 數(shù)據(jù)采集與處理

noesypr1d 脈沖序列采集樣品，采用預(yù)飽和方法進(jìn)行水峰抑制，核磁參數(shù)為：

延遲時(shí)間（d1）3 s，譜寬（SWH）8 012.82 Hz，中心頻率 （O1）2 350.61 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)（TD）32 768，信號(hào)累加次數(shù)（NS）128 次，空掃次數(shù)（DS）4次，自動(dòng)接收增益（rga），試驗(yàn)溫度（298.0±0.1）K，壓制脈沖功率51.04 dB。

采用Mestrenova 14.0 對(duì)核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，對(duì)得到的一維1H NMR 譜圖進(jìn)行基線校正和相位校正，基線校正選擇伯恩斯坦多項(xiàng)式，以溶劑內(nèi)標(biāo)3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸鈉（TMS）化學(xué)位移為0.000 定標(biāo)，將處理好的NMR 譜圖在δ=0.5～10化學(xué)位移范圍按照每段寬度為0.004 進(jìn)行分段積分，構(gòu)成2 350×70 矩陣，剔除δ=3.30～3.38（甲醇溶劑殘留信號(hào)）和δ=4.80～4.97（水殘留信號(hào)）區(qū)間的信號(hào)，對(duì)信號(hào)峰的峰面積進(jìn)行歸一化處理，將所得到的積分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入Excel 文件，以樣本種類為X變量，分段積分峰面積為Y 變量導(dǎo)入SIMCA 14.0 軟件（v14.0，Umetrics，瑞典）分別進(jìn)行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂蜜1H NMR 的前處理方法優(yōu)化

蜂蜜中以糖類為主要成分，此外還含有游離氨基酸、黃酮類和酚酸類物質(zhì)。蜂蜜的1H NMR 譜圖可分為3 部分，分別是脂肪區(qū)（δ=0.5～3.0），糖類化合物區(qū)（δ=3.0～6.0）和芳香區(qū)（δ=6.0～10.0），不同區(qū)域信號(hào)的差異體現(xiàn)了不同蜜源蜂蜜的代謝物差異，為了更好地獲得不同區(qū)域的信號(hào)，本研究參考文獻(xiàn)[14-17]對(duì)比了4 種前處理方法：一是取10 g蜂蜜樣本，用15 mL 去離子水溶解，置于50 mL 離心管中，加入15 mL 三氯甲烷振蕩10 min，10 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集氯仿層，旋蒸濃縮蒸干，600 μL 氘代氯仿溶解后上機(jī)分析信號(hào)區(qū)域集中在δ=3.0～5.0 之間，然而該法易乳化提取效率低，脂肪酸信號(hào)干擾強(qiáng)度大；二是取20 g 蜂蜜樣本，用15 mL 去離子水超聲溶解，用1 mol/L HCl調(diào)pH 值至1，過濾后吸取600 μL 待測溶液加入100 μL 丙酸三甲硅鈉（Sodium trimethylsilylpropionate，TSP），采用預(yù)飽和壓制水峰法測試，發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖會(huì)掩蔽其它化合物的信號(hào)；三是取10 g 蜂蜜樣本各2 份，用50 mL 水溶解，用1 mol/L HCl 調(diào)pH 值至2，分別用Amberlite XAD-2 （2 cm×20 cm）柱色譜和Oasis HLB （500 mg）固相萃取法，酸水洗脫后用甲醇收集樣品，旋蒸濃縮蒸干，用600 μL 氘代甲醇溶解，核磁分析顯示該前處理方法可較好地去除糖信號(hào)的干擾，將次生代謝產(chǎn)物的信號(hào)顯示出來，然而由于這類化合物的含量較低，10 g 的取樣量用核磁分析基線噪音大，增加了積分的不準(zhǔn)確度；四是基于DLLME 原理優(yōu)化出1.1 節(jié)的樣品制備方法，分析顯示在δ 0.5～10.0 范圍的不同區(qū)域均獲得了良好的信號(hào)，可以有效地將糖信號(hào)和次生代謝產(chǎn)物信號(hào)的差異一并體現(xiàn)（圖1），從而建立單花蜜的整體代謝物指紋譜，且提取效率高，適用于核磁分析樣本的代謝組學(xué)前處理方法。

圖1 葵花蜜、麥盧卡蜜、荊條蜜和洋槐蜜的1H NMR 譜（氘代甲醇，500 MHz）Fig.1 1H NMR spectra of sunflower honey，Manuka honey，vitex honey and acacia honey （MeOD，500 MHz）

2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析

2.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)一般都呈現(xiàn)一個(gè)偏態(tài)分布（右偏），因此首先對(duì)所有變量進(jìn)行l(wèi)og轉(zhuǎn)換使數(shù)據(jù)更為對(duì)稱，其次根據(jù)Hotelling’s T2 Range 計(jì)算是否滿足正態(tài)分布，選擇T2 值滿足99%置信區(qū)間的變量作為觀察變量，本研究所有變量均滿足正態(tài)分布可納入觀察。此外在蜂蜜中，不同類型化合物含量差別很大，如糖類化合物含量較高，游離氨基酸、酚酸和黃酮等成分含量低，為避免濃度差異對(duì)結(jié)果的影響，提高模型的預(yù)測能力，優(yōu)化數(shù)據(jù)信息的提取，本研究對(duì)比了3 個(gè)不同標(biāo)段換算方式對(duì)數(shù)據(jù)的影響，其中中心化換算（Mean Center Scaling，Ctr）得到的NMR 的線性負(fù)載圖與原始譜最為接近，但對(duì)模型的解釋能力較差，自適換算（Unit Variance Scaling，UV）有利于分析含量較低代謝物的變化趨勢，但得到的NMR 線性負(fù)載圖畸變較為嚴(yán)重，而帕萊托換算（Pareto Scaling，Par）集中了中心化換算和自適化換算的優(yōu)缺點(diǎn)，本課題采用Par 換算可獲得理想的模型評(píng)價(jià)質(zhì)量參數(shù) （R2X=0.770，R2Y=0.932，Q2=0.876），其中R2代表模型對(duì)數(shù)據(jù)矩陣的解釋能力，Q2代表模型整體的預(yù)測能力。

2.2.2 主成分分析 采用非監(jiān)督模式（PCA）對(duì)所有蜂蜜樣品進(jìn)行差異分析，其優(yōu)勢是能在不具備任何樣品分組信息的情況下通過對(duì)高維數(shù)據(jù)降維，實(shí)現(xiàn)所有蜂蜜代謝物內(nèi)在關(guān)系的可視化，PCA分析前3 個(gè)主成分特征值累積占總方差70.63%，其中第1 主成分占50.1%，如圖2所示，根據(jù)PCA得分圖可以看出，麥盧卡蜂蜜和其它3 種蜂蜜明顯區(qū)分，集中在第2 象限，洋槐蜜集中在第1 象限，葵花蜜集中在第4 象限，而荊條蜜靠近中心位置，表明其特征性不明顯。

圖2 蜂蜜PCA 得分圖Fig.2 PCA score plots of honeys

2.2.3 模型識(shí)別與驗(yàn)證 通過多變量分析建立模型的可靠性驗(yàn)證是進(jìn)行后期數(shù)據(jù)分析的重要前提，為了進(jìn)一步運(yùn)用OPLS-DA 模型建立代謝物表達(dá)量與樣品類別之間的關(guān)系模型，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品類別的預(yù)測，避免模型獲得分類的偶然性，需先通過模型驗(yàn)證的PLS 模型再進(jìn)行OPLS-DA 處理。本研究分別通過內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證2 種方法對(duì)模型進(jìn)行識(shí)別和驗(yàn)證，內(nèi)部驗(yàn)證以模型擬合的Q2值表示模型的預(yù)測能力，如圖3a所示，所建模型對(duì)4種蜂蜜的判別解釋能力達(dá)93.2%（R2Y=0.932），對(duì)未知樣本的預(yù)測能力為87.6%（Q2=0.876）。考慮內(nèi)部驗(yàn)證方法與建立模型的多種因素相關(guān)，常常會(huì)提高最終模型的預(yù)測能力使模型出現(xiàn)過擬合趨勢，因此采用排列試驗(yàn)（Permutation test）對(duì)模型進(jìn)行外部交叉驗(yàn)證（n=200）[10，18]，如圖3b所示，回歸線斜率大，與縱軸的截距小，R2=0.234 不超過0.3～0.4，Q2=-0.31 表明模型未過擬合且穩(wěn)健，提示模型數(shù)據(jù)可靠，具有很好的穩(wěn)定性和預(yù)測性，可以進(jìn)一步做OPLS-DA 分析尋找差異變量。

圖3 模型驗(yàn)證Fig.3 Validate model plots

2.2.4 OPLS-DA 分析 為了有效識(shí)別不同蜂蜜組間的差異代謝物核磁信號(hào)，對(duì)不同來源的單花蜜進(jìn)行了兩兩OPLS-DA 分析，得分圖如圖4a，4c，4e，4g 和4i所示，所建模型對(duì)區(qū)分洋槐蜜和荊條蜜、洋槐蜜和葵花蜜、洋槐蜜和麥盧卡蜜、葵花蜜和麥盧卡蜜，荊條蜜和麥盧卡蜜的判別解釋能力分別為 0.978，0.985，0.984，0.993 和 0.982，預(yù)測能力分別為0.935，0.971，0.983，0.943 和0.967。經(jīng)過OPLS-DA 分析的數(shù)據(jù)可進(jìn)一步通過相關(guān)關(guān)系圖（Coefficient Plot）表示，以NMR 譜的化學(xué)位移（變量）為橫軸，縱軸代表與模型有關(guān)所有變量的相關(guān)系數(shù)值，相關(guān)系數(shù)較高的代謝物呈現(xiàn)熱色系，相關(guān)系數(shù)較低的代謝物表現(xiàn)冷色系[10]，如圖4b，4d，4f，4h 和4j所示，選擇相關(guān)系數(shù)大于0.8 的強(qiáng)變量對(duì)應(yīng)的核磁分段位移，荊條蜜和洋槐蜜對(duì)比顯著的差異代謝物信號(hào)為δ=7.32～7.34，7.37～7.38，6.85，7.23 等芳香氫質(zhì)子或苯丙酸類化合物的烯氫信號(hào)（荊條蜜）；洋槐蜜和葵花蜜對(duì)比顯著的差異代謝物信號(hào)在δ=1.7～3.0 的脂肪氫信號(hào)區(qū)（洋槐蜜）及δ=4.54，5.21，8.27～8.31 的信號(hào)區(qū)（葵花蜜）；麥盧卡蜜對(duì)比其它3 種蜂蜜的特征信號(hào)在δ=0.5～3.0，3.90～4.10，4.31～4.35，4.95，6.83～6.85，7.16～7.25，7.25～7.31，9.35～9.38 多個(gè)區(qū)域，這些變量可作為潛在的標(biāo)記物，需進(jìn)一步富集蜂蜜制備并結(jié)合二維核磁共振波譜分析開展結(jié)構(gòu)鑒定研究。

圖4 兩兩組間OPLS-DA 分析得分圖及相關(guān)系數(shù)圖Fig.4 OPLS-DA score plots and correlation coefficient diagrams between each two groups

3 結(jié)論

本文基于植物代謝組學(xué)，采用核磁共振技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)不同來源單花蜜開展差異分析研究。通過對(duì)比不同文獻(xiàn)方法優(yōu)化了蜂蜜核磁分析的前處理方法，避免蜂蜜中大量的糖掩蓋其它低含量特征性強(qiáng)的化合物的信號(hào)，更好地涵蓋到脂肪區(qū)（δ=0.5～3.0）、糖類化合物區(qū)（δ=3.0～6.0）和芳香區(qū)（δ=6.0～10.0）不同區(qū)域的信號(hào)；采用log 轉(zhuǎn)換和帕萊托換算方式預(yù)處理核磁數(shù)據(jù)并深度挖掘，利用PCA 模型可以很好地區(qū)分洋槐蜜、荊條蜜、葵花蜜和麥盧卡蜜，并對(duì)模型進(jìn)行了內(nèi)外部驗(yàn)證；構(gòu)建了兩兩組間OPLS-DA 模型的載荷圖和相關(guān)系數(shù)分析用于洋槐蜜和荊條蜜、洋槐蜜和葵花蜜、洋槐蜜和麥盧卡蜜、葵花蜜和麥盧卡蜜、荊條蜜和麥盧卡蜜的組間代謝標(biāo)志物的識(shí)別，并找到了相應(yīng)的核磁分段位移作為特征性變量。該方法簡單、快速，具有分析時(shí)間短、完整性強(qiáng)、專屬性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以擴(kuò)展到多種不同蜜源單花蜜的區(qū)分識(shí)別，為不同單花蜜的質(zhì)量評(píng)價(jià)建立有效方法和預(yù)測模式，為單花蜜的品質(zhì)分析與規(guī)范蜂產(chǎn)品市場提供技術(shù)支持。