郭志華，王 聰，陳紅玲

（1 宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院 安徽宿州 234000 2 宿州學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院 安徽宿州 234000）

紅茶菌飲料是以紅茶水為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而成的一種功能性飲料[1]。紅茶菌中的微生物主要包括醋酸菌、酵母菌和乳酸菌[2]。紅茶菌發(fā)酵液中含有茶葉的浸出物，活的微生物及其代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗癌，提高免疫力等保健功能。

乳酸菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，可發(fā)酵碳水化合物生成乳酸等有機(jī)酸，廣泛存在于動(dòng)物腸道、植物表面、發(fā)酵乳制品、泡菜、青貯飼料等環(huán)境中[3]。乳酸菌不僅有利于食品發(fā)酵，而且能夠提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，對(duì)人體的生理功能起到較好的調(diào)節(jié)作用[4]。

為充分了解紅茶菌中乳酸菌的功能特性，從紅茶菌中分離純化具有降解亞硝酸鹽能力的優(yōu)良乳酸菌，通過(guò)形態(tài)觀察、生化性質(zhì)測(cè)定和16S rDNA 菌株鑒定，研究其發(fā)酵性能、耐胃腸道性和黏附性能等功能，并評(píng)價(jià)紅茶菌中乳酸菌的安全性，為更好地開發(fā)紅茶菌提供安全優(yōu)質(zhì)的乳酸菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MC 培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶對(duì)照培養(yǎng)基和血瓊脂平板，廣東環(huán)凱公司；MRS 肉湯培養(yǎng)基，杭州百思公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，北京天根公司；16S 上、下游引物，上海生工；抗菌藥敏紙片，杭州微生物公司；HiBio 生化鑒定試劑盒，Hi-Media 公司。其余均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

722 型紫外-可見分光光度計(jì)，上海儀電；My-Cycler PCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)Bio-Rad；SW-CJ-1D 超凈工作臺(tái)，上海滬凈；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海尚儀。

1.3 方法

1.3.1 降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選 蘸取紅茶菌汁在MC 平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，用滅菌牙簽挑取有明顯溶鈣圈的單菌落接入MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。接觸酶反應(yīng)陰性，革蘭氏染色鏡檢陽(yáng)性的菌株初步鑒定為乳酸菌。

將初步鑒定為乳酸菌的菌株活化，按體積分?jǐn)?shù)5%接種于含有125 mg/L NaNO2的MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h，菌液離心后取上清液2 mL，加入2 mL 對(duì)氨基苯磺酸溶液，避光靜置5 min，再加入1 mL 鹽酸萘乙二胺溶液，避光靜置15 min，觀察各菌株培養(yǎng)液的顏色變化，選出顏色較淺的菌株[5]。

1.3.2 篩選乳酸菌的鑒定

1.3.2.1 形態(tài)特征觀察 篩選出的菌株在MRS 平板劃線，觀察單菌落顏色、大小、質(zhì)地、邊緣等培養(yǎng)特征；革蘭氏染色鏡檢菌體顏色、菌體性狀和排列方式。

1.3.2.2 生化鑒定 采用HiBio 生化鑒定試劑盒，進(jìn)行七葉苷水解試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、木糖發(fā)酵試驗(yàn)、纖維二糖發(fā)酵試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)、半乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、甘露糖發(fā)酵試驗(yàn)、蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)、棉子糖發(fā)酵試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)、海藻糖發(fā)酵試驗(yàn)、阿伯拉糖發(fā)酵試驗(yàn)等生化試驗(yàn)，根據(jù)顏色變化判斷試驗(yàn)是陽(yáng)性還是陰性。

1.3.2.3 16S rDNA 的擴(kuò)增和序列分析 提取乳酸菌基因組，用細(xì)菌通用引物27f 和1492r 擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA 的保守序列，PCR 產(chǎn)物測(cè)序后與Genbank 數(shù)據(jù)進(jìn)行BLAST 核酸數(shù)據(jù)比對(duì)[6]。

1.3.3 篩選乳酸菌功能特性研究

1.3.3.1 發(fā)酵特性研究

1）降解亞硝酸鹽能力測(cè)定 乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)5%接種于含有125 mg/L NaNO2的MRS 液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，每隔3 h 測(cè)定培養(yǎng)液中NaNO2含量，計(jì)算培養(yǎng)液中亞硝酸鹽降解率。

NO2-降解率（%）=（初始NO2-含量-培養(yǎng)后NO2-含量）/初始NO2-含量%

亞硝酸鹽含量的測(cè)定采用GB/T 5009.33-2010《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中鹽酸萘乙二胺分光光度法[7]。

2）產(chǎn)酸能力測(cè)定 按體積分?jǐn)?shù)5%接種于MRS 液體培養(yǎng)基，每3 h 測(cè)培養(yǎng)液的pH 值和滴定酸度。

總酸的測(cè)定按GB/T 12456-2008 《食品中總酸的測(cè)定》進(jìn)行，總酸含量以乳酸計(jì)[8]。

1.3.3.2 耐胃腸道研究 將含有125 mmol/L Na-Cl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3的溶液滅菌，溶解胃蛋白酶，過(guò)濾除菌，胃蛋白酶終質(zhì)量濃度為3 g/L，調(diào)pH 值到2.5，制得人工胃液[9]。

將含有45 mmol/L NaCl 和3 g/L 的牛膽鹽溶液滅菌，溶解胰蛋白酶，過(guò)濾除菌，胰蛋白酶終質(zhì)量濃度為1 g/L，調(diào)pH 值到8.0，制得人工腸液[9]。

將乳酸菌按5%接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。低溫離心收集菌體，將菌體分別重懸人工胃液和人工腸液3 h 和6 h，收集菌液，根據(jù)GB 47892-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，耐受性以存活率計(jì)算，公式如下：

存活率（%）=lgN1/lgN0×100

式中，N1——經(jīng)耐受處理后的活菌數(shù)（CFU/mL）；N0——耐受處理前的活菌數(shù)（CFU/mL）。

1.3.3.3 黏附性能測(cè)定

1）表面疏水性測(cè)定[10]將乳酸菌活化后接種到MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，低溫離心收集菌體，用無(wú)菌PBS（pH 7.0）洗滌菌體兩次，重懸于0.1 mol/L KNO3溶液中，在波長(zhǎng)600 nm 處調(diào)吸光度值為0.6，記為A0。將1 mL 二甲苯、氯仿和乙酸乙酯分別加入3 mL 菌液中，混勻后放置10 min 再混勻，放置20 min，在波長(zhǎng)600 nm 處測(cè)上層吸光度值，記為At。

通過(guò)公式計(jì)算乳酸菌黏附有機(jī)溶劑的百分比，即乳酸菌的疏水率。

疏水率（%）=（1-At/A0）×100

2）自凝聚測(cè)定[11]將乳酸菌37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，低溫離心收集菌體，用無(wú)菌PBS（pH 7.0）洗滌菌體兩次，重懸無(wú)菌PBS 中，在波長(zhǎng)600 nm 處調(diào)吸光度值為0.6，記為Ao。取3 mL 菌液振蕩混勻10 s，37 ℃靜置1，2，3 h 和4 h，取1 mL 上清液，在600 nm 處測(cè)吸光度值，記為At。

自動(dòng)聚集率/%=（1-At/Ao）×100

3）黏附率的測(cè)定[12]將乳酸菌37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，低溫離心收集菌體，用無(wú)菌PBS（pH 7.0）洗滌菌體兩次，重懸DMEM 培養(yǎng)液中，將Caco-2 細(xì)胞置CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)至單層細(xì)胞，用胰酶-EDTA 消化液消化后重懸DMEM 培養(yǎng)液中。制備好的細(xì)胞懸液置于24 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)至單層細(xì)胞。將100 μL 乳酸菌懸液和900 μL DMEM 培養(yǎng)液加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，置CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)90 min，用無(wú)菌PBS 洗滌細(xì)胞兩次，除去未黏附的菌體。再加入1 mL Triton100（體積分?jǐn)?shù)為1%），使Caco-2 與黏附菌體分開，培養(yǎng)液根據(jù)GB 47892-2010 進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，通過(guò)公式計(jì)算乳酸菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附率。

黏附率（%）=黏附菌數(shù)/每孔中添加菌數(shù)×100

1.3.3.4 安全性評(píng)價(jià)

1）耐藥性檢測(cè) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法將菌液培養(yǎng)至105～106CFU/mL，涂布在MRS 瓊脂平板上，將無(wú)菌水紙片、青霉素G 紙片、阿莫西林紙片、四環(huán)素紙片、萬(wàn)古霉素紙片、氯霉素紙片和紅霉素紙片貼于MRS 瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑大小[13]。

2）有害代謝物評(píng)價(jià) 氨基脫羧酶試驗(yàn)：在滅菌后的氨基酸脫羧酶培養(yǎng)基中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.005%的5-磷酸吡哆醛，乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)5%接入上述液體培養(yǎng)基中，每24 h轉(zhuǎn)接1 次，轉(zhuǎn)接6～8 次后，按10%的量分別接入對(duì)應(yīng)的氨基脫羧酶培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3～4 d 后觀察試驗(yàn)管（加入氨基酸接入乳酸菌）與空白管（不加氨基酸接入乳酸菌）的顏色變化?？瞻坠転辄S色，若試驗(yàn)管為黃色，則結(jié)果為陰性；若試驗(yàn)管為紫色，則結(jié)果為陽(yáng)性[14]。

硝酸鹽還原酶檢測(cè)試驗(yàn)：乳酸菌活化后，按體積分?jǐn)?shù)5%接入硝酸鹽培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 d，滴加KI 溶液和淀粉溶液，同時(shí)做空白試驗(yàn)。培養(yǎng)液變藍(lán)色為陽(yáng)性，不變色為陰性[15]。

溶血試驗(yàn)：挑取活化后的乳酸菌在血瓊脂平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察有無(wú)溶血圈，同時(shí)用金黃色葡萄球菌作為陽(yáng)性對(duì)照比較[15]。

吲哚試驗(yàn)：把乳酸菌按體積分?jǐn)?shù)5%接入蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h 后加入2 mL 乙醚，充分震蕩，待乙醚浮在上層液面，沿管壁加入吲哚試劑，觀察兩層交界處顏色變化[11]。

所有試驗(yàn)均做3 次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良乳酸菌的篩選

MC 培養(yǎng)基中含有CaCO3，乳酸菌發(fā)酵糖產(chǎn)酸使菌落周圍CaCO3溶解產(chǎn)生溶鈣圈，產(chǎn)酸越強(qiáng)，溶鈣圈越大。從紅茶菌中共分離出有明顯溶鈣圈的菌株42 株。紅茶菌中含有較多產(chǎn)酸的醋桿菌和酵母菌，鏡檢革蘭氏陽(yáng)性同時(shí)接觸酶陰性的有27株，初步鑒定為乳酸菌，編號(hào)為HCR-1、HCR-2、HCR-3……。

分離的乳酸菌，按體積分?jǐn)?shù)5%接入含有NaNO2的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)36 h，NaNO2與對(duì)氨基苯磺酸生成重氮鹽，重氮鹽再與鹽酸萘乙二胺進(jìn)行偶合反應(yīng)生成紫紅色的偶氮化合物[5]。MRS 液體培養(yǎng)基中的NaNO2經(jīng)乳酸菌降解，降解能力越強(qiáng)，NaNO2含量越低，顏色越淺。不同乳酸菌降解NaNO2能力不同，其中HCR-8、HCR-20 和HCR-24 顯色較淺。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征觀察 篩選3 株菌在MRS 固體培養(yǎng)基上的菌落較小，呈白色，圓形，表面光滑濕潤(rùn)。3 株乳酸菌的鏡檢如圖1所示，HCR-8 和HCR-24 革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體均為桿狀，鏈狀排列；HCR-20 革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體短桿狀，成對(duì)或鏈狀排列。

圖1 3 株乳酸菌的鏡檢圖Fig.1 Microscopic examination of three strains of lactic acid bacteria

2.2.2 生化鑒定 采用HiBio 生化鑒定試劑盒檢測(cè)HCR-8、HCR-20、HCR-24 對(duì)碳源的利用能力，結(jié)果七葉苷水解試驗(yàn)、纖維二糖發(fā)酵試驗(yàn)、麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)、甘露糖發(fā)酵試驗(yàn)、蜜二糖發(fā)酵試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)和海藻糖發(fā)酵試驗(yàn)均為陽(yáng)性；木糖發(fā)酵試驗(yàn)、阿拉伯糖發(fā)酵試驗(yàn)、半乳糖發(fā)酵試驗(yàn)和棉籽糖發(fā)酵試驗(yàn)均為陰性。

2.2.3 16 S rDNA 的擴(kuò)增和序列分析 以乳酸菌的DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增得到約1.5 kb 片段（圖2）。將16S rDNA 的測(cè)序結(jié)果提交NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HCR-8 和HCR-24 與植物乳桿菌同源性為97%，HCR-20 與干酪乳桿菌同源性為98%。

圖2 3 株乳酸菌16S rDNA 序列擴(kuò)增電泳圖Fig.2 Electrophoresis pattern of 16S rDNA sequence amplification of three strains of lactic acid bacteria

根據(jù)乳酸菌菌落特征、菌體形態(tài)特征、糖發(fā)酵試驗(yàn)和16S rDNA 的序列分析，HCR-8 和HCR-24 鑒定為植物乳桿菌，HCR-20 鑒定為干酪乳桿菌[16]。

2.3 乳酸菌功能特性

2.3.1 發(fā)酵特性

2.3.1.1 產(chǎn)酸能力 從圖3可看出HCR-8、HCR-20 和HCR-24 在6～15 h 間pH 值和總酸度含量變化幅度較大，組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），乳酸菌處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，菌體數(shù)量不斷增加，產(chǎn)酸量不斷升高。15 h 后產(chǎn)酸量趨于平緩（P＞0.05），可能是菌體生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期。其中HCR-20 產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，發(fā)酵至21 h，pH 值降至3，27 h 時(shí) pH 值降至2.7；HCR-8 其次，發(fā)酵至24 h，pH 值降至3；HCR-24發(fā)酵至27 h，pH 值降至3.4。乳酸菌在厭氧環(huán)境下，利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸[17]，與乳酸菌的抑菌性、降低亞硝酸鹽能力等有關(guān)[18]。

圖3 3 株乳酸菌生長(zhǎng)過(guò)程中pH 值和酸度的變化Fig.3 Changes of pH value and acidity of three strains of lactic acid bacteria in growth

2.3.1.2 降解亞硝酸鹽能力 由圖4可看出，3 株乳酸菌隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株降解亞硝酸鹽能力增強(qiáng)。在6～15 h 間，亞硝酸鹽降解率上升幅度較大，組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），第15 小時(shí)亞硝酸鹽降解率是第6 小時(shí)的7～8 倍，這與產(chǎn)酸特性一致。6～15 h 乳酸菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體數(shù)量增幅較大。3 株乳酸菌發(fā)酵至24 h，亞硝酸鹽降解率均在90%左右；發(fā)酵至27 h，亞硝酸鹽降解率大于或等于93%，其中HCR-20 亞硝酸鹽降解率達(dá)99%。乳酸菌降解亞硝酸鹽與pH 值呈顯著負(fù)相關(guān)，與總酸度呈正相關(guān)[18]，當(dāng)pH 值小于4.0 時(shí)，亞硝酸鹽的降解主要是酸降解。

圖4 3 株乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中亞硝酸鹽降解率的變化Fig.4 Changes of nitrite degradation rate of three strains of lactic acid bacteria in growth

2.3.2 耐胃、腸道環(huán)境研究 人們?cè)陲嬘眉t茶菌時(shí)，一般無(wú)需加熱直接飲用，乳酸菌進(jìn)入人體后，只有活菌順利通過(guò)胃抵達(dá)小腸，才能對(duì)宿主起到益生作用[19]，這就要求乳酸菌能夠耐受胃、腸道的環(huán)境。流體食物在胃內(nèi)停留時(shí)間約2～3 h，人體胃液pH 值通常在3.0 左右，食物經(jīng)胃液消化后進(jìn)入小腸，在小腸停留時(shí)間約2～6 h，因此本研究選擇人工胃液的pH 3.0，消化時(shí)間3 h；人工腸液的pH 8.0，消化時(shí)間6 h[20]。HCR-8、HCR-20、HCR-24 對(duì)人工胃、腸液的耐受性見表1。3 株菌在人工胃液消化3 h 后，存活率分別為 （46.00±0.16）%，（62.00±0.20）%和（39.00±0.11）%，3 株菌有顯著性差異（P＜0.05），其中HCR-20 的存活率大于60%。3 株菌在人工腸液消化6 h 后存活率均大于50%，3 株菌沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。

表1 3 株乳酸菌耐胃腸道環(huán)境研究Table 1 Three strains of lactic acid bacteria resistant to gastrointestinal tract

2.3.3 黏附性能 乳酸菌進(jìn)入人體后，不僅要耐受胃、腸道環(huán)境，還要具有良好的腸道黏附性能，才能最終定殖在腸道發(fā)揮其益生特性[21]。本文研究了HCR-8、HCR-20、HCR-24 的表面疏水性、自凝聚性和體外Caco-2 細(xì)胞黏附性。

2.3.3.1 表面疏水性 微生物細(xì)胞表面疏水性是微生物細(xì)胞重要的理化性質(zhì)之一，主要影響細(xì)菌非特異性吸附到生物表面[22]。菌體的表面疏水性能反映其黏附性，疏水性越強(qiáng)，對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附作用越強(qiáng)[23]。3 株乳酸菌的疏水性見圖5。3 株乳酸菌對(duì)氯仿的疏水性均高于乙酸乙酯，尤其是HCR-20 對(duì)氯仿的疏水性大于80%，組間顯著性差異（P＜0.05）。氯仿是酸性溶劑，屬電子受體，而乙酸乙酯是單堿性溶劑，屬電子供體[21]，這3 株乳酸菌都是電子供體。二甲苯是一種非極性溶劑，除菌株HCR-24 外，HCR-8 和HCR-20 對(duì)二甲苯的疏水性均大于50%，說(shuō)明這兩株菌都有疏水的細(xì)胞表面。

圖5 3 株乳酸菌在3 種有機(jī)溶劑中的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of three strains of lactic acid bacteria in three organic solvents

2.3.3.2 自凝聚 3 株乳酸菌分別在2，4，6 h 的自凝聚率測(cè)定結(jié)果如圖6所示。2 h 時(shí)，3 株菌的自凝聚率分別為32%，36%和19%，其中HCR-8和HCR-20 顯著高于HCR-24（P＜0.05）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所有菌株凝聚率逐漸增大，HCR-8 和HCR-20 自凝聚率增速顯著高于HCR-24 （P＜0.05）。HCR8 和HCR-20 在起始渦旋震蕩后沉降較快，4 h 后菌懸液的上層溶液澄清，而HCR-24在6 h 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)上層溶液較渾濁。結(jié)合疏水性試驗(yàn)結(jié)果，菌株的自聚集性與表面疏水性相一致，即表面疏水性強(qiáng)的菌株也具有較強(qiáng)的自聚集性，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21]。

圖6 3 株乳酸菌自凝聚性Fig.6 Three strains of lactic acid bacteria self-cohesive

2.3.3.3 黏附率測(cè)定 乳酸菌要發(fā)揮益生作用，首先要黏附到腸上皮細(xì)胞，通過(guò)體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)價(jià)乳酸菌的黏附性能較困難，可以用體外模擬，Caco-2細(xì)胞為人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞，無(wú)論是形態(tài)還是功能都與動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞非常接近[23]，被廣泛用作體外細(xì)胞模型來(lái)評(píng)價(jià)乳酸菌的黏附性能。篩選的3 株乳酸菌與Caco-2 細(xì)胞共培養(yǎng)90 min 后，除去未黏附的菌體，黏附的乳酸菌根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)（GB 4789-2010）進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，乳酸菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附率見圖7。3株乳酸菌的黏附率存在較明顯的菌株差異性（P＜0.05），其中HCR-20 的黏附率最高17%，HCR-8和HCR-24 的黏附率分別為14%和9%。

圖7 3 株乳酸菌對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附率Fig.7 Adhesion rate of three strains of lactic acid bacteria to Caco-2 cells

2.3.4 安全性評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.4.1 耐藥性 隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，微生物的耐藥性問(wèn)題日益嚴(yán)重。含有乳酸菌的發(fā)酵產(chǎn)品食用前一般不進(jìn)行加熱或消毒等處理，耐藥性基因可能通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體腸道并在腸道內(nèi)積累和傳播，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在的威脅[25]。選取常用的9 種抗生素，3 株乳酸菌的耐藥試驗(yàn)結(jié)果見表3。供試3 株乳酸菌對(duì)9 種抗生素的敏感性參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)劃分為敏感（S）、中度敏感（I）和耐藥（R）3 個(gè)等級(jí)[25]。由表2可知，3 株乳酸菌對(duì)大部分抗生素均未產(chǎn)生耐藥性，只對(duì)慶大霉素產(chǎn)生耐藥性，而多數(shù)乳酸菌對(duì)氨基糖苷類抗生素具有天然耐受能力[25]。

表2 3 株乳酸菌耐藥性檢測(cè)結(jié)果Table 2 Three strains of lactic acid bacteria resistance test results

2.3.4.2 有害代謝物評(píng)價(jià) 3 株乳酸菌有害代謝物評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。如果乳酸菌具有氨基脫羧酶活性，則可分解氨基酸生成胺和二氧化碳[26]。培養(yǎng)基pH 值升高，顯堿性，滴加溴甲酚紫，呈黃色為陰性，說(shuō)明沒(méi)有發(fā)生脫羧反應(yīng)；如呈紫色，則說(shuō)明發(fā)生脫羧反應(yīng)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，這3 株菌均表現(xiàn)出陰性反應(yīng)，說(shuō)明它們的代謝產(chǎn)物中均不含有氨基脫羧酶。硝酸鹽還原酶可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽是強(qiáng)致癌物亞硝胺的前體物質(zhì)[15]。3株乳酸菌硝酸還原酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有培養(yǎng)液均未變藍(lán)，為陰性反應(yīng)，說(shuō)明3 株菌中不含有硝酸鹽還原酶。通過(guò)吲哚試驗(yàn)可檢測(cè)乳酸菌是否產(chǎn)生色氨酸酶，該酶能夠分解色氨酸產(chǎn)生吲哚，色氨酸是人體必需氨基酸，色氨酸分解會(huì)引起肝功能衰退，惡性腫瘤等疾病[15]。吲哚試驗(yàn)中3 株乳酸菌的培養(yǎng)液均未變色，說(shuō)明未產(chǎn)生吲哚類物質(zhì)，試驗(yàn)結(jié)果為陰性。很多細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生溶血素，使血液中的紅細(xì)胞破裂溶解，3 株乳酸菌均沒(méi)有溶血圈，說(shuō)明它們對(duì)紅細(xì)胞沒(méi)有影響。

表3 3 株乳酸菌有害代謝物評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of harmful metabolites of three strains of lactic acid bacteria

3 討論與結(jié)論

紅茶菌中的乳酸菌有的是天然存在的，有的是人為加入的。植物乳桿菌和干酪乳桿菌都屬于乳桿菌屬，可發(fā)酵產(chǎn)酸、細(xì)菌素等多種抑菌物質(zhì)，能夠抑制和殺死發(fā)酵食品中的腐敗菌和致病菌[27]。許多乳桿菌可產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)，使發(fā)酵食品具有特殊風(fēng)味。乳桿菌具有很多生理功能，包括耐受胃、腸環(huán)境，與人體上皮細(xì)胞黏附，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低膽固醇，預(yù)防心血管疾病，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收及維持腸道內(nèi)菌群平衡等[28]。紅茶菌中乳酸菌不僅有助于抑制紅茶菌中雜菌和致病菌的生長(zhǎng)，還可改善紅茶菌的風(fēng)味與口感，賦予紅茶菌更多益生特性。

乳酸菌能發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，抑制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖，使產(chǎn)品質(zhì)量得到有效控制。亞硝酸鹽對(duì)環(huán)境和人類均造成嚴(yán)重危害，亞硝酸鹽能形成具有強(qiáng)致癌作用的亞硝胺類物質(zhì)，長(zhǎng)期攝入可誘發(fā)癌變[29]，乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽有很好的降解作用[29]。本研究以產(chǎn)酸和降解亞硝酸鹽能力為指標(biāo)篩選優(yōu)良乳酸菌。乳酸菌在發(fā)酵的前期，培養(yǎng)液pH 值＞4.5 時(shí)，乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽降解以亞硝酸鹽還原酶降解為主；發(fā)酵后期，乳酸菌產(chǎn)生酸，培養(yǎng)液pH 值降低，pH 值＜4.0 后，亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主[29]。其中HCR-20發(fā)酵27 h，發(fā)酵液pH 值降到2.7，產(chǎn)酸能力優(yōu)于林龍鎮(zhèn)等[30]從酸性風(fēng)味食品中篩選的戊糖乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌，且優(yōu)于常見的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌等[31]。HCR-20 發(fā)酵27 h 對(duì)亞硝酸鹽降解率達(dá)99%，高于丁娟芳等[32]從揚(yáng)州醬菜中篩選的乳酸腸球菌亞硝酸鹽降解率為91.7%；程方方等[33]從酸馬乳中篩選的腸膜明串珠菌亞硝酸鹽降解率88.91%；吳慧昊等[34]從食品和動(dòng)物腸道中篩選的玉米乳桿菌，亞硝酸鹽降解率達(dá)到93.47%。

乳酸菌若要發(fā)揮改善腸道菌群結(jié)構(gòu)、抑制腸道致病菌等功能則要求其能夠克服胃、腸道中的物理及化學(xué)因素的影響，以活菌狀態(tài)到達(dá)胃、腸道[9]。HCR-8，HCR-20 和HCR-24 經(jīng)人工胃液和腸液處理后均有一定的存活率。乳酸菌進(jìn)入人體后，具有良好的腸道黏附性能，最終定殖于腸道發(fā)揮其益生特性。HCR-20 對(duì)氯仿的疏水性大于80%，HCR-8 和HCR-20 對(duì)二甲苯的疏水性大于50%。3 株乳酸菌的自凝聚性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增大，HCR-20 對(duì)Caco-2 細(xì)胞的黏附率達(dá)17%。通過(guò)對(duì)3 株乳酸菌的安全性評(píng)價(jià)可知：3 株菌對(duì)大部分常見的抗生素均無(wú)抗性；不會(huì)產(chǎn)生氨基脫羧酶和色氨酸酶，不含有硝酸還原酶，不會(huì)產(chǎn)生溶血現(xiàn)象。

本試驗(yàn)從紅茶菌中篩選的3 株乳酸菌，具有良好的降解亞硝酸鹽能力，能耐受胃、腸道環(huán)境，不會(huì)產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，為特定功能益生菌的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。