諶 迪，肖朝耿*，盧文靜，葉 沁，唐宏剛，張 怡，張治國，周天瓊

（1 浙江省農業(yè)科學院食品科學研究所 杭州 310021 2 上海市農業(yè)科學院農產品保鮮加工研究中心 上海 201403 3 杭州華津藥業(yè)股份有限公司 杭州 311241）

豬腦鮮嫩可口，富含蛋白質、腦磷脂和各種礦物質，可増加機體的免疫力，是傳統(tǒng)的健腦食品[1]。Sharma 等[2]發(fā)現豬腦水解產物多肽可以減緩腦水腫，抑制神經元損傷。林元藻等[3]發(fā)現豬腦水解物可顯著增強小鼠的學習記憶能力。研究表明，豬腦多肽對大腦的改善作用可能與其NSC-34 細胞的神經保護作用有關，然而過高濃度的豬腦多肽會抑制細胞的增殖[4]。臨床上，Ziganshina 等[5]發(fā)現豬腦多肽可以改善急性缺血性腦卒中患者的癥狀并延緩病情進展，其水解物還可用于治療神經系統(tǒng)疾病并預防年齡依賴性癡呆[6-8]。Guekht 等[9]將豬腦多肽水解物用于治療認知能力逐漸喪失的血管型失智。豬腦多肽水解物可以通過提高腦組織無氧代謝的ATP 生成量、減少氧自由基生成等作用機制促進腦代謝，增加腦活性[10]。臨床上采用豬腦水解物治療腦功能障礙疾病已有數十年，早在上世紀我國就已開發(fā)出中藥制劑用于治療頭痛，如鎮(zhèn)腦寧就是以豬腦為原料開發(fā)而成，采用乳豬制備的腦活性多肽與價格昂貴的進口腦活素具有類似作用[11]。腦活素已在臨床上廣泛應用40 多年，已知腦活素是75%游離氨基酸和25%短鏈肽的混合物，短肽可能是其生理活性成分[12]。綜上，豬腦多肽具有重要的藥學價值。

與酸堿水解等方法相比，生物酶解法制備多肽具有專一性強，反應條件溫和，反應過程容易控制，對環(huán)境友好，無毒性物質產生等優(yōu)點[13-15]。采用酶解制備的生物活性肽具有抗氧化、抗菌、免疫調節(jié)等多種功能[16-19]。豬腦酶解產物已被用于治療腦功能障礙疾病，如奧地利生產的腦活素（Cerebrolyzin），日本生產的Ceremon 及德國、羅馬尼亞生產的Crelizin 都是通過酶水解腦蛋白獲得的制劑。豬腦多肽可保護神經元防止大腦損傷，還能預防炎癥，抑制細胞凋亡[20]。豬腦多肽水解物中的活性短肽與內源神經營養(yǎng)因子有類似的作用[21]。基于促增殖活性優(yōu)化豬腦多肽的提取制備技術很有必要。

本文以豬腦蛋白為材料，通過胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶等制備豬腦促增殖肽，采用色譜法比較豬腦酶解液中多肽分子質量的分布。確定了豬腦促增殖肽培養(yǎng)小鼠神經干細胞的條件，基于NE-4C 神經干細胞模型，考查了加酶量，酶解溫度、酶解時間和pH 值等對其促增殖活性的影響，以NE-4C 促增殖活性為指標，通過正交法優(yōu)化酶解工藝，以期為豬腦促增殖肽的制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鮮豬腦，購自農貿市場。胰蛋白酶（1∶250）、胃蛋白酶（1∶30 000），上海源葉生物科技有限公司；脂肪酶（Palatase 2000L，20 000 U/g），諾維信（中國）生物技術有限公司；標準牛血清蛋白，生工生物工程（上海）股份有限公司；Eagle MEM 培養(yǎng)基，Gibco 公司；胎牛血清，Hyclon 公司；MTT 試劑盒，南京凱基生物技術有限公司；多聚賴氨酸（cat#P-9155），Sigma 公司；谷氨酰胺（35050）、非必需氨基酸（100×，11140），Invitrogen 公司；其它試劑均為國產分析純級。

1.2 主要儀器與設備

5424R 冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；Spectra MAX190 全波長酶標儀，美國MD 公司；超濾設備，美國Millipore 公司；超凈工作臺，HITIK公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo 公司；pH 計，上海三星儀器有限公司；ULTRA-TURRAXT1.8basic 勻漿機，德國IKA 公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；粉碎機，德清拜杰電器有限公司；烘箱，上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 豬腦促增殖肽制備酶的篩選 冷凍的鮮豬腦自然解凍后，除去血塊和腦膜（軟腦膜和蛛網膜），用生理鹽水沖洗，均質機勻漿得到豬腦勻漿[22]，密封于冰箱中冷藏儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 NE-4C 神經干細胞培養(yǎng) 將Eagle MEM、胎牛血清、谷氨酰胺和非必需氨基酸（100×）按88∶10∶1∶1 的比例在無菌條件下制備小鼠神經干細胞完全培養(yǎng)液。細胞復蘇及傳代前至少提前2 h在T25 培養(yǎng)瓶中鋪15 μg/mL 多聚賴氨酸進行預處理。在無菌件下，將NE-4C 細胞接種于小鼠神經干細胞完全培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2）環(huán)境培養(yǎng)，每天更換完全培養(yǎng)基。當細胞生長至培養(yǎng)瓶總體積的70%～80%時，用0.25%胰酶消化，多聚賴氨酸預處理2 h 后傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。試驗所需細胞取自同代。

1.3.3 MTT 法測定NE-4C 的細胞促增殖活性促增殖活性檢測參考文獻并作適當修改[23]：將NE-4C 細胞按2 000 個/孔接種至96 孔板中，接種前2 h 用15 μg/mL 多聚賴氨酸預處理T25 培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過夜去后去掉培養(yǎng)基。酶解液中多肽含量用Bradford 法檢測[24]，用完全培養(yǎng)基將豬腦多肽稀釋至0.5 mg/mL，培養(yǎng)NE-4C 細胞48 h，每孔加入50 μL MTT 工作液4 h 后去掉培養(yǎng)基，加入150 μL 二甲亞砜（DMSO）混勻，室溫搖床15 min，于波長492 nm 處檢測吸光值。

1.3.4 色譜法檢測酶解后豬腦多肽分子質量分布 采用高效凝膠滲透色譜法對豬腦多肽的分子質量分布進行表征，參考文獻中方法并作適當修改[25]。色譜條件：Ultrahydrogel TM Linear 2 根串聯（7.8 mm×300 mm），柱溫45 ℃，流動相0.1 mol/L NaNO3，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL。采用RID示差折光檢測器進行檢測。用流動相配制1.0 mg/mL 豬腦多肽酶解物及系列葡聚糖標準品溶液，過0.22 μm 水系濾膜后分析。系列標準樣品的保留時間和對應分子質量的對數值，由GPC 軟件自動分析并生成分子質量標準曲線。待測樣品色譜圖中各個峰的相對分子質量由GPC 軟件基于標準曲線自動計算。

1.3.5 加酶量、pH 值、酶解溫度和酶解時間對促增殖活性的影響 準確稱取豬腦勻漿（1.00±0.01）g，置于250 mL 錐形瓶中，加入200 mL 去離子水，磁力攪拌30 min，依次研究加酶量、pH 值、酶解溫度和酶解時間對酶解液促增殖活性的影響。

1.3.6 豬腦促增殖肽提取工藝優(yōu)化 針對豬腦促增殖肽提取制備工藝，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化胰蛋白酶的加入量（A，mg）、pH 值（B）、酶解溫度（C，℃）以及酶解時間（D，h），因素與水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3.7 數據統(tǒng)計試驗結果 通過SPSS 18.0 軟件分析，組間差異比較采用One-way ANOVA 檢驗比較其差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 豬腦促增殖肽制備酶的篩選

由圖1a 可知，與對照組相比，胰蛋白酶酶解豬腦后，其多肽水解物的促增殖活性顯著高于對照組（P＜0.05），而胃蛋白酶及脂肪酶的酶解產物與對照組無顯著性差異（P＞0.05），這可能與胰蛋白酶酶解豬腦后，其小分子質量多肽占比較高相關。很多調控促進細胞增殖的多肽以短肽的形式存在，分子質量較小，如蠶蛹蛋白肽[26]、成骨生長肽[27]及神經肽P 物質[28]等。

由圖1b 可以發(fā)現，采用胰蛋白酶酶解豬腦蛋白，隨著酶解物中多肽質量濃度的增加，對NE-4C 細胞的促增殖能力提高，但當質量濃度高于5 mg/mL 時，促增殖能力未出現繼續(xù)增強的現象，因此，豬腦多肽添加質量濃度為5 mg/mL 時，可適于NE-4C 細胞培養(yǎng)。

圖1 不同豬腦酶解物對NE-4C 細胞促增殖活性的影響Fig.1 Effects of different enzymic hydrolysis on proliferative activities of porcine brain

2.2 豬腦酶解物中多肽分子質量分布

由圖2和表2可知，豬腦勻漿液在未酶解前，其多肽含量較低，儀器無法檢出。胃蛋白酶、胰蛋白酶及復合酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解）酶解豬腦蛋白后，多肽分子質量分布主要集中在2 000 u 以下。胰蛋白酶酶解產物中，多肽分子質量分布主要集中在500 u 以下，而此分子質量的多肽多表現出較高的生物活性[29]。豬腦經胰蛋白酶酶解后，分子質量在180～500 u 范圍的多肽占總多肽含量的41.42%，其次為分子質量低于180 u 的多肽，占30.67%，均高于胃蛋白酶和復合酶酶解產物，表明在制備豬腦小分子肽方面，胰蛋白酶優(yōu)于胃蛋白酶及復合酶。

圖2 豬腦酶解物中多肽分子質量分布Fig.2 Polypeptide molecular weight distribution of porcine brain enzymic hydrolysates

表2 豬腦酶解液中多肽分子質量分布Table 2 Polypeptides molecular weight distribution of porcine brain enzymic hydrolysates

復合酶酶解液中大于5 000 u 和5 000～3 000 u 范圍的多肽含量均低于另外2 種酶，分別僅占總多肽含量的0.10%和0.61%。結果表明，復合酶可以提高分子質量小于2 000 u 的多肽比例，然而制備分子質量小于180 u 多肽的效果不如胰蛋白酶，推測胰蛋白酶酶解產物的促增殖活性與其較高比例分子質量小于180 u 的短肽相關。

2.3 各因素對促增殖活性的影響

由圖3可知，加酶量為20 mg 和30 mg 時，豬腦促增殖肽的活性最強；隨著酶解時間的增加，促增殖活性逐漸增加，但無顯著性差異；酶解溫度為30 ℃時，制備的豬腦促增殖肽活性最低，而當酶解溫度為45 ℃時可顯著增加其促增殖活性；pH 值對促增殖活性的影響無顯著性差異。

圖3 不同因素對豬腦多肽促增殖活性的影響Fig.3 Effects of different factors on the proliferative activity of porcine brain polypeptides

2.4 豬腦多肽制備的最適條件

根據單因素實驗結果，按表1中所列的因素與水平，以促增殖活性為指標，通過L9（34）正交試驗優(yōu)化豬腦促增殖肽提取工藝，結果見表3。

此試驗研究了4 個因素對豬腦促增殖肽酶解工藝的影響，分別是加酶量、pH 值、酶解溫度和酶解時間。由表3可以看出，影響酶解工藝的主次因素依次是加酶量、酶解時間、酶解溫度和pH 值。較優(yōu)水平是加酶量25 mg，酶解時間4 h，酶解溫度45 ℃，pH 7.5。在最適條件下，NE-4C 相對活力為0.161。

表3 L9 （34）正交試驗Table 3 L9 （34）orthogonal tests

3 結論

本試驗通過酶促水解豬腦制備促增殖肽，以酶解液的促增殖能力為指標，發(fā)現胰蛋白酶較胃蛋白酶和脂肪酶更適合用于豬腦促增殖肽的制備。利用高效凝膠滲透色譜法發(fā)現胰蛋白酶解產物中分子質量小于500 u 的多肽占總多肽含量的72.09%，特別是分子質量小于180 u 的多肽含量為30.67%，遠高于胃蛋白的8.75%和復合酶的5.62%，表明胰蛋白酶酶解豬腦產物的促增殖活性與其較高比例的低分子質量肽相關。針對胰蛋白酶的加酶量、酶解時間、酶解溫度和pH 值設計正交試驗，最終得到較優(yōu)水平為加酶量25 mg，酶解時間4 h，酶解溫度45 ℃，pH 7.5。在最適條件下，NE-4C 相對活力為0.161。本試驗制備的豬腦多肽具有一定的促增殖活性，可作為功能性配料應用于相關食品中，為豬腦的高值化利用提供了新的參考。