姬妍茹，張正海，楊慶麗，滕春波，董 艷，石 杰，劉 玉，魏連會

（1 黑龍江省科學(xué)院大慶分院 黑龍江大慶 163319 2 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150040）

鮮菊芋（Jerusalem artichoke），又稱洋姜，屬菊科多年生草本植物，原產(chǎn)于北美溫帶地區(qū)，現(xiàn)今在我國西北地區(qū)廣泛種植[1]。菊芋塊莖中富含菊粉，約占其干重的80%，由2～70 個果糖聚合而成，具有促進機體礦物質(zhì)吸收，降低膽固醇，調(diào)節(jié)免疫功能，對抗肥胖等生理功能[2-3]。作為一種具有益生元特性的膳食纖維，果聚糖的聚合度對菊粉的益生功能起決定性的作用，聚合度越小，活性越高[4]。一方面，低聚果糖通過刺激腸道雙歧桿菌等有益菌生長，有助于抑制腸道感染，維持腸道菌群健康[5]。另一方面，在結(jié)腸內(nèi)，低聚果糖經(jīng)細菌發(fā)酵，產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可以增加糞便含水量及膨脹能力，促進腸道蠕動，提高腸動力[6]。

鮮菊芋口感較差且不耐貯存，多用于腌制醬菜，而黑菊芋是以鮮菊芋為原料，在高溫、高濕條件下經(jīng)自然發(fā)酵制作的新型功能食品，擁有獨特的味道和口感，深受眾多品嘗者的歡迎[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，菊芋經(jīng)熱加工后，總酚、酚酸、有機酸、脂肪酸和糖的種類和含量發(fā)生變化，其中尤以糖類的變化最為明顯[8-9]，果聚糖聚合度顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，膳食補充黑菊芋后，小鼠腸道α-葡萄糖苷酶活性得到提高[10]，然而其對益生活性的影響尚需探討。

本研究以KM 小鼠為研究對象，基于16S rDNA 高通量測序技術(shù)，分析黑菊芋對小鼠腸道菌群的影響并采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)檢測小鼠盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸含量，探究黑菊芋的益生活性，為進一步開發(fā)和利用黑菊芋提供新的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮菊芋，“慶芋2 號”品種，由黑龍江省農(nóng)科院大慶分院提供；黑菊芋，以“慶芋2 號”為原料，采用變溫熟成技術(shù)制備，具體方法參考文獻[8]。

低聚果糖（FOS），山東保齡寶生物股份有限公司；糞便基因組提取試劑盒，德國凱杰（QIAGEN）公司；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和正戊酸標準品，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

SPF 級雌性KM 小鼠，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司【生產(chǎn)許可證：SCXK（吉）-2018-0007】，體質(zhì)量（20±2）g。小鼠飼養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物實驗室，環(huán)境條件為溫度（25±2）℃、濕度（50±5）%、12 h 光照和12 h 黑夜的環(huán)境中，自由取食、進水。

1.3 儀器與設(shè)備

黑菊芋熟成加工設(shè)備，黑龍江省科學(xué)院大慶分院自主研發(fā)；P-100S 超聲清洗機，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；VFD-4500 型冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；MiSeq 高通量測序系統(tǒng)，美國Illumina 公司；CT15RT 型離心機，上海天美科技有限公司；ISQ 系列LT 單四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 黑菊芋提取液的制備 黑菊芋[11]切片，稱取0.1 kg，加入0.5 L 蒸餾水浸泡16 h，勻漿后超聲30 min，過濾并凍干，蒸餾水調(diào)整至所需給藥濃度，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 小鼠腸道菌群試驗 隨機將50 只健康KM雌性小鼠分為5 組，即空白對照組（無菌生理鹽水，CK）、陽性對照組 （0.83 g/kg bw 低聚果糖，F(xiàn)OS）、黑菊芋低劑量組（0.05 g 黑菊芋，BL）、黑菊芋中劑量組（0.1 g 黑菊芋，BM）、黑菊芋高劑量組（0.2 g 黑菊芋，BH），灌胃劑量為0.2 mL/10 g bw，試驗期為15 d，分別于第1 天和第15 天稱量小鼠體質(zhì)量。第14 天，停止飼喂10 h，再給予相應(yīng)日糧，解剖小鼠后切取盲腸于無菌離心管中，置于液氮中保存，用于糞便菌群分析和短鏈脂肪酸（SCFA）含量的檢測[12]。

1.4.3 16 S rDNA 文庫構(gòu)建與高通量測序 根據(jù)糞便基因組提取試劑盒說明書提取小鼠糞便中微生物總DNA。采用末端連接測序接頭的細菌通用引物對V3～V4 區(qū)進行PCR 擴增和純化，構(gòu)建測序文庫。測序試驗由北京百邁客生物科技有限公司完成，并根據(jù)97%的序列相似度使用QIIME 工具包進行分類操作單元（Operational taxonomic units，OTUs）分類。

1.4.4 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量的測定 取0.3 g 樣品加入2.0 mL 磷酸水溶液（V磷酸∶V水=1∶3），渦旋振蕩2 min，加入1.0 mL 乙醚萃取10 min，以4 000 r/min 在0 ℃條件下離心20 min。重復(fù)萃取1 次，合并上清液，濃縮至1.0 mL 以內(nèi)，用0.22 μm 微孔膜過濾后進樣分析。氣相質(zhì)譜分析采用TG WAXMS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；色譜柱溫度設(shè)定程度：初始柱溫100 ℃，持續(xù)5 min，再以5 ℃/min 升至150 ℃，隨后以30 ℃/min的速率升至240 ℃，持續(xù)30 min；載氣：99.99%高純氦氣；載氣流量：1.0 mL/min；進樣口溫度：240℃；進樣方式：分流進樣；分流比：75∶1；進樣量：10 μL；電子轟擊離子源（EI）能量：70 eV；單離子掃描模式：定量離子60，73；離子源溫度：200 ℃；傳輸線溫度：250 ℃。

圖1 短鏈脂肪酸混合標準品氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 GC-MS total ion current chromatogram of mixed standard of short-chain fatty acid

1.4.5 統(tǒng)計學(xué)分析 試驗結(jié)果采用Graphpad Prism 7.0 軟件處理并繪制，One-way ANOVA 進行單因素方差分析，并進行Turkey 事后檢驗，P＜0.05 時認為具有顯著性差異，P＜0.01 時認為具有極顯著性差異。

表1 6 種短鏈脂肪酸標品的標準曲線Table 1 The standard curves of six short-chain fatty acid

2 結(jié)果與分析

2.1 灌胃黑菊芋對KM 小鼠體質(zhì)量的影響

如圖2所示，各組小鼠體質(zhì)量在15 d 后均有所增加，F(xiàn)OS 組體質(zhì)量增加最多 （5.630 g），CK 組最低（4.063 g），BL 組和BM 組與CK 組差異不顯著，但極顯著低于FOS 組（P＜0.01）；BH 組極顯著高于CK 組（P＜0.01），但與FOS 組差異不顯著（P＞0.05），表明黑菊芋對小鼠的正常生長無不良影響。

2.2 序列長度分布

通過Illumina Miseq 測序統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理各階段樣品序列數(shù)目，評估數(shù)據(jù)質(zhì)量。如圖2所示，經(jīng)質(zhì)控過濾后，優(yōu)化序列平均長度為420.33 bp，可覆蓋細菌16S rDNA V3～V4 區(qū)序列全長。

圖2 灌胃前、后各組小鼠體質(zhì)量差Fig.2 Changes in body weight of mice before and after intragastric administration

2.3 OTU 劃分和分類地位鑒定

采用QIIME[12]（Version 1.8.0）軟件，統(tǒng)計各樣本OUT 數(shù)量，分析腸道微生物組成。篩選除去原始OTU 聚類結(jié)果中極低豐度的OTU（豐度小于0.005%），共獲得335 個OUT，包括1 界、10 門、14綱、19 目、32 科、79 屬、80 種。

2.4 α 多樣性分析及曲線繪制

圖3 高質(zhì)量序列長度分布圖Fig.3 High quality distribution of sequence length

利用Mothur （Version v.1.30.）軟件對樣本α多樣性進行評估，并繪制稀釋性曲線（Rarefaction curve），香農(nóng)指數(shù)曲線（Shannon Index）和等級豐度曲線（Rank Abundance Curve）。如圖4所示，各組稀釋性曲線均趨于平緩，說明更多的測序數(shù)據(jù)量只可能產(chǎn)生少量的新物種；OUT 等級豐度曲線有足夠的寬度和平坦度，說明物種的組成豐富，均勻程度高；香農(nóng)指數(shù)曲線隨著測序深度的增加已經(jīng)基本達到飽和，可見當前測序深度足夠大，OUT可以反映樣本中絕大多數(shù)的微生物物種信息。

圖4 α 多樣性指數(shù)曲線Fig.4 Alpha diversity index curves

2.5 β 多樣性分析

利用距離熱圖，對樣本間物種群落多樣性差異程度進行量化分析。如圖5所示，CK 組樣本與其它組樣本距離較遠，說明經(jīng)黑菊芋和FOS 干預(yù)后，確實改變了小鼠腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)。

圖5 樣品間距離熱圖Fig.5 Heatmap of the distance between samples

2.6 黑菊芋對小鼠腸道菌群組成的影響

圖6直觀呈現(xiàn)出各樣本中微生物在門和屬水平的相對豐度。門水平上，各組小鼠腸道菌群構(gòu)成主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、變形菌門（Proteobacteria）和髕骨細菌門（Patescibacteria）菌等，其中厚壁菌門和擬桿菌門占比超過80%，為優(yōu)勢菌群。與CK 組相比，BL 和BH 組菌群表現(xiàn)為厚壁菌門豐度下降，擬桿菌門豐度上升。有研究表明，肥胖與體內(nèi)厚壁菌門豐度升高和擬桿菌門豐度下降密切相關(guān)[13]，擬桿菌門擁有更廣泛的多糖降解酶和碳水化合物代謝通路，因此適量食用黑菊芋可能會有助于控制小鼠體脂含量。

圖6 物種分布柱形圖Fig.6 Column diagram of species distribution

黑菊芋干預(yù)組的脫鐵桿菌門菌群豐度高于CK 組，Li 等[14]發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，腸癌模型組小鼠的脫鐵桿菌豐度由1.9%降至0.9%，黨參治療后恢復(fù)到1.2%，這種趨勢提示黑菊芋可能通過提高脫鐵桿菌的豐度降低腸癌的發(fā)生。黑菊芋干預(yù)組和FOS 組的髕骨細菌門菌群數(shù)量均顯著低于CK 組，而且呈現(xiàn)隨灌胃劑量增加，菌群數(shù)量減少的趨勢。髕骨細菌門的細菌在缺氧環(huán)境中被發(fā)現(xiàn)，目前在實驗室中尚未實現(xiàn)離體培養(yǎng)，研究人員認為髕骨細菌門的細菌屬于新的超級類群，該類群包含小基因組菌總門，Parcubacteria 和纖細菌門[15]，對髕骨細菌門細菌的基因組進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)其基因組通常小于1 Mb，代謝能力嚴重下降，無潛在的附著和黏附蛋白，缺乏生物合成能力和DNA 修復(fù)能力說明髕骨細菌門的細菌是其它生物體的外共生生物或寄生生物[16]，迄今為止鮮有在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)髕骨細菌門的細菌以及關(guān)于髕骨細菌門的細菌對小鼠腸道功能影響的相關(guān)報道。黑菊芋干預(yù)組的放線菌門菌群豐度呈現(xiàn)隨灌胃劑量增加而增加的趨勢，然而均低于CK 組，而FOS 組則高于CK 組。變形菌門中包含大腸桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞桿菌、胃幽門螺旋桿菌等多類致病菌，與CK 組相比，BM 和BH 組的變形菌門含量略有升高，具體原因有待進一步研究。

在屬水平上，以乳酸菌屬（Lactobacillus），擬桿菌科的未純培養(yǎng)菌f Muribaculaceae 屬、毛螺菌科的NK4A136 group 屬、黏液性細菌屬（Mucispirillum）等為腸道優(yōu)勢菌群。除BM 組外，各組的乳酸菌數(shù)量均少于CK 組，正常情況下，F(xiàn)OS 有促進乳酸菌增殖的作用，而本研究中結(jié)果剛好相反，具體原因尚不明確。Muribaculaceae 以往也被稱作S24-7，具有促進腸道代謝的功能，在相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)以有益菌狀態(tài)存在[16-17]或與腸道黏膜免疫系統(tǒng)相關(guān)[18]。除BH 組外，黑菊芋干預(yù)組小鼠腸道中毛螺菌豐度明顯高于CK 組（P＜0.05）。毛螺菌科的NK4A136 group 屬于厚壁菌門，是腸道有益菌，該門的普拉氏梭桿菌（F.prausnitzii）和人源羅氏菌（Roseburia hominis）等多數(shù)細菌可以通過產(chǎn)生抗炎性丁酸鹽，為腸黏膜提供營養(yǎng)，維持腸黏膜免疫功能[19]。有研究表明黏液性細菌屬可拮抗沙門氏菌毒性，從而保護小鼠免受結(jié)腸炎感染[20]。本研究中除CK 組外，各組的黏液性細菌豐度均有大幅度下降，具體原因尚待探究。

2.7 黑菊芋對小鼠盲腸中短鏈脂肪酸的影響

短鏈脂肪酸（SCFA）被稱為“腸道菌群的功能性核心類群”，是連接膳食纖維和腸道菌群與腸道健康的關(guān)鍵代謝物，在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)的建立和維持中起著關(guān)鍵作用。短鏈脂肪酸由腸道細菌發(fā)酵低聚果糖等膳食纖維產(chǎn)生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸和戊酸等，SCFA 的含量變化間接反映出腸道微生物的活性情況[21]。

由表2可見，小鼠經(jīng)黑菊芋干預(yù)后，黑菊芋干預(yù)組的乙酸含量降低（與CK 組相比），這點與腸道菌群中乳酸菌含量降低相吻合；BM 和BH 組的丙酸含量顯著高于CK 組 （P＜0.05 或P＜0.01），然而與FOS 組差異不顯著，推測黑菊芋通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群中擬桿菌含量，增加了丙酸鹽產(chǎn)生的潛力；黑菊芋干預(yù)組的正戊酸含量顯著高于CK組和FOS 組（P＜0.05 或P＜0.01）；黑菊芋干預(yù)組的正丁酸含量顯著高于CK 組（P＜0.01），其中BH 組的正丁酸含量還顯著高于FOS 組 （P＜0.01）；Van den Abbeele 等[22]發(fā)現(xiàn)菊粉能促進益生菌增殖，降解黏蛋白并產(chǎn)生丁酸和丙酸等有益的代謝產(chǎn)物，防止促炎因子侵入，進而提高腸道屏障功能，改善宿主腸道健康。

表2 小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量Table 2 Contents of short chain fatty acids in mice cecum

3 結(jié)論

KM 小鼠灌胃黑菊芋后，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其中0.05～0.1 g 黑菊芋在不影響乳酸菌豐度的前提下，可以顯著增加擬桿菌目未純培養(yǎng)細菌f Muribaculaceae 菌和毛螺菌科NK4A136 group菌的豐度，顯著降低黏液性細菌豐度；灌胃黑菊芋可以顯著增加小鼠腸道中丙酸，正丁酸和正戊酸的含量，對改善小鼠的腸道健康，增強抗炎能力有所幫助。本研究為揭示黑菊芋的保健功能提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。