魏秋紅，高 歡，劉曉月，翟婧卉，宋燕青

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部 長(zhǎng)春 130000）

炎癥性腸病 （Inflammatory bowel disease，IBD）主要病變部位是結(jié)腸黏膜和黏膜下層，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉及血便等[1]。相關(guān)研究表明，炎癥因子、活性氧以及外源性有害物質(zhì)均能夠?qū)е聶C(jī)體自發(fā)免疫通路活化，直接或間接調(diào)控炎癥通路的激活和炎癥因子的釋放，最終導(dǎo)致腸黏膜病理性損傷[2]。

通過不同酶解方法可獲得具有抗炎、抗病毒、抗高血壓和抗腫瘤等功能的蛋清蛋白活性肽，在營(yíng)養(yǎng)食品和藥物研發(fā)方面具有重要的意義[3-4]。本研究用水解蛋清蛋白短肽（HEpep）是以蛋清蛋白為原料，通過酶解方法獲得平均分子質(zhì)量為1 300 u 的短肽，擬建立LPS 所致大鼠結(jié)腸炎癥模型，通過免疫組化染色、生化試劑盒檢測(cè)等多種技術(shù)手段觀察HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸炎是否具有緩解作用，分析其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只（200～220 g），由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0191551。所有大鼠飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保證光照/黑暗時(shí)間各12 h 循環(huán)交替；保證大鼠正常飲食和飲水；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（吉）2018-0001。

1.2 材料與試劑

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、過氧化氫酶（Catalase，CAT）檢測(cè)試劑盒，碧云天生物科技有限公司。腫瘤壞死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）試劑盒，聯(lián)科生物科技有限公司；TUNEL 試劑盒，羅氏生物科技公司；DAB 顯色試劑盒（20×）、KIT-9921 即用型免疫組化試劑盒（鼠/兔），福州邁新試劑生物技術(shù)開發(fā)有限公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.3 儀器與設(shè)備

分析天平 （精度0.001 g），日本島津公司；BX53 生物光學(xué)顯微鏡，Olympus 公司；高速低溫離心機(jī)，BIO-RAD 公司；7600-210 酶標(biāo)儀，HITACHI 公司；RM2235 石蠟切片機(jī)，Leica 公司；1525 高效液相色譜儀、2487 紫外檢測(cè)器，Waters公司。

1.4 水解蛋清蛋白肽的制備

1.4.1 水解蛋清蛋白肽的制備工藝 水解蛋清蛋白短肽（HEpep，Mw=1 310 u）制備工藝如下：蛋清蛋白→酶解→酶解液→膜分離→濃縮噴霧干燥→蛋清蛋白肽。

1.4.2 水解蛋清蛋白肽分子質(zhì)量的測(cè)定 采用高效液相色譜儀進(jìn)行分子質(zhì)量的測(cè)定；色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動(dòng)相為V乙腈∶V水∶V三氟乙酸=45∶55∶0.1；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，流速0.5 mL/min，柱溫30 ℃[5]。

1.4.3 HEpep 氨基酸含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取HEpep 樣品0.5 g 于水解管中，加入5 mL 水溶解并滴加適量濃鹽酸，混勻。向水解管中充入高純氮?dú)?，采用酒精噴燈密封水解管，冷卻后置于（105±1）℃的恒溫干燥箱內(nèi)水解21 h。冷卻后將水解液轉(zhuǎn)移至20 mL 刻度試管定容。吸取濾液1 mL 至10 mL 刻度試管中，于40～50 ℃真空條件水浴加熱干燥。殘留物經(jīng)0.02 mol/L 鹽酸溶液溶解后定容至10 mL，0.2 μm 濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)[6]。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組及樣品采集 60 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、蛋清蛋白肽高劑量組和低劑量組，每組15 只。HEpep 高【2 g/（kg·d）】、低劑量組【1 g/（kg·d）】連續(xù)7 d 分別灌胃給藥，空白組和模型組采用生理鹽水進(jìn)行同步處理；第7 天給藥結(jié)束后，所有大鼠腹腔注射LPS 10 mg/kg，給藥8 h 后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血并收集結(jié)腸組織，用于生化指標(biāo)檢測(cè)和HE 染色。

1.5.2 生化指標(biāo)的測(cè)定 按照試劑盒說明書對(duì)各組SD 大鼠血清和組織中的SOD 活力、MDA 水平、CAT 活力、TNF-α 和IL-6 含量進(jìn)行檢測(cè)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清和組織中各項(xiàng)指標(biāo)的含量。

1.5.3 結(jié)腸組織HE 染色 取各組結(jié)腸接近部位新鮮組織于10%多聚甲醛中固定、脫水，經(jīng)石蠟包埋后切片，HE 染色觀察結(jié)腸組織的病理變化。

1.5.4 TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 采用TUNEL染色法檢測(cè)組織細(xì)胞凋亡情況。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作：常規(guī)石蠟切片脫蠟→經(jīng)蛋白酶K 工作液在37 ℃處理15 min→PBS 沖洗3～5 次→加入TUNEL 反應(yīng)混合液（含TdT 酶和dUTP）→反應(yīng)體系放于暗盒中37 ℃孵育1 h→PBS 沖洗3～5次→加封閉液，放于暗盒中37 ℃孵育0.5 h→PBS沖洗3～5 次→加入DAB 底物，室溫反應(yīng)5 min→PBS 沖洗3～5 次→蘇木素復(fù)染→切片經(jīng)梯度酒精、二甲苯依次處理后，中性樹膠封片→采用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.5.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以±s 表示，多組間采用單因素方差分析，以P＜0.05 為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEpep 分子質(zhì)量分布

采用高效液相色譜法測(cè)定HEpep 分子質(zhì)量分布，結(jié)果見圖1，檢測(cè)結(jié)果表明，HEpep 主要由小分子肽組成，其中分子質(zhì)量在2 500 u 以下的組分大于95%，平均分子質(zhì)量1 310 u。

圖1 HEpep 分子質(zhì)量分布圖譜Fig.1 Molecular weight distribution of HEpep

2.2 HEpep 的氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果

本研究對(duì)HEpep 的氨基酸含量進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示，HEpep 中必需氨基酸占氨基酸總量的35.92%。

表1 HEpep 的氨基酸含量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Results of amino acid content of HEpep

2.3 HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化的影響

如圖2所示，空白組結(jié)腸組織表面光滑，無潰瘍、炎癥及水腫出現(xiàn)；模型組結(jié)腸組織出現(xiàn)明顯的炎性變化，腸腔內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腸上皮出現(xiàn)嗜酸性變、破損，杯狀細(xì)胞大量缺失、固有層較多炎細(xì)胞浸潤(rùn)；HEpep 低劑量組部分腸上皮細(xì)胞、結(jié)腸腺上皮細(xì)胞出現(xiàn)嗜酸性變，固有層較多炎細(xì)胞，整體損傷情況較模型組減輕；HEpep 高劑量組結(jié)腸組織腸腔內(nèi)炎細(xì)胞少見，上皮黏膜層較為規(guī)整，固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，炎癥反應(yīng)明顯減輕，說明HEpep 能夠緩解LPS 所致大鼠結(jié)腸炎癥損傷，其保護(hù)作用隨給藥劑量的增加而增加。

圖2 大鼠遠(yuǎn)端結(jié)腸組織病理學(xué)HE 染色（×40）Fig.2 HE staining of distal colonic tissues in rats（×40）

2.4 HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸組織和血清中炎癥因子水平的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比模型組大鼠結(jié)腸組織和血清中的炎癥因子均顯著升高，而HEpep 處理能夠有效降低血清及組織中的炎癥因子水平，其中高劑量組改善效果更加明顯。

2.5 HEpep 對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比LPS 模型組大鼠血清中的抗氧化物質(zhì)SOD 和CAT 活力顯著下降（P＜0.05），而脂質(zhì)過氧化物MDA 水平顯著升高，提示存在氧化應(yīng)激損傷；與模型組相比不同劑量蛋清蛋白肽組SD 大鼠血清中抗氧化物水平均不同程度升高，MDA 水平下降，其中高劑量組改善效果更加明顯。

圖3 HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸組織和血清中炎癥因子水平的影響Fig.3 Effects of HEpep on the levels of inflammatory factors in colon tissues and serum

圖4 HEpep 對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響Fig.4 Effects of HEpep on the antioxidant capacity in serum

2.6 HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸組織抗氧化能力的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，與空白組相比LPS 模型組大鼠結(jié)腸組織中的抗氧化物質(zhì)SOD 和CAT 酶活力顯著下降（P＜0.05），而脂質(zhì)過氧化物MDA 水平顯著升高，提示存在氧化應(yīng)激損傷；與模型組相比不同劑量HEpep 組SD 大鼠結(jié)腸組織中抗氧化物水平均不同程度升高，MDA 水平下降，其中高劑量組改善效果更加明顯。

圖5 HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸組織抗氧化能力的影響Fig.5 Effects of HEpep on the antioxidant capacity in colon tissues

2.7 HEpep 對(duì)大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL 法能夠標(biāo)記出凋亡細(xì)胞的數(shù)量和分布，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞呈深棕色為凋亡細(xì)胞。圖6表明，空白組大鼠結(jié)腸上皮偶見凋亡細(xì)胞，模型組凋亡細(xì)胞明顯增多，說明LPS 誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生，促使細(xì)胞凋亡，使結(jié)腸上皮黏膜屏障受損；HEpep 低、高劑量組使結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡明顯減少，表明HEpep 能夠緩解LPS 所致炎癥反應(yīng)，使結(jié)腸上皮黏膜屏障損傷減輕，抑制細(xì)胞凋亡。

圖6 大鼠結(jié)腸組織TUNEL 染色結(jié)果（×100）Fig.6 TUNEL staining of colon tissues（×100）

3 結(jié)論與討論

蛋清蛋白因其廣泛的生物學(xué)特性，在營(yíng)養(yǎng)食品和制藥工業(yè)的開發(fā)和研究中廣泛應(yīng)用[7-8]。蛋清蛋白不僅在人類日常飲食中提供營(yíng)養(yǎng)，在體內(nèi)經(jīng)胃腸蛋白酶解消化后產(chǎn)生的生物活性肽也具有重要的調(diào)節(jié)功能[3-4]。相關(guān)研究表明，蛋清蛋白經(jīng)胃腸蛋白酶（如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）和植物、微生物來源蛋白酶（如木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和熱溶酶）水解后可獲得不同肽鏈長(zhǎng)度的活性蛋白肽[9]，而不同的肽序列生物功能各異，包括抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）、抗氧化、抗炎、抑制鐵/鈣離子結(jié)合以及緩解高血壓、糖尿病等，因此具有重要的研究?jī)r(jià)值[10-12]。相關(guān)研究表明，蛋清多肽（如RADHPFL、YAEERYPIL 和IVF）口服或注射給藥時(shí)通過有效抑制ACE 活性，對(duì)于自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果與卡托普利持平甚至更優(yōu)[13]。蛋清蛋白通過酶解作用可產(chǎn)生抗氧化氨基酸，包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸等[14]，可清除體內(nèi)超氧陰離子和羥自由基（·OH）[15]，維持機(jī)體氧化還原平衡，而不同肽鏈序列（如WNIP、GWNI、IRW 和LKP）抗氧化能力也存在較大差異[16-17]。此外，部分短肽（如GW）表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗炎和抗腫瘤活性[18]。因此，蛋清蛋白來源的生物活性肽可作為藥物成分，具有重要的發(fā)展前景。本研究檢測(cè)氨基酸含量后發(fā)現(xiàn)，HEpep 氨基酸含量127.68 mg/g，其中必需氨基酸占氨基酸總量的35.92%，符合FAO/WHO 對(duì)肽類產(chǎn)品的要求，具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

細(xì)菌內(nèi)毒素LPS 可誘導(dǎo)結(jié)腸組織細(xì)胞發(fā)生炎癥應(yīng)答和氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，而游離的氧自由基可進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)繼而損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能[19]。本研究通過檢測(cè)血清和結(jié)腸組織中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)SOD、CAT 酶活力和MDA 含量水平，發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白來源的短肽HEpep 能夠有效改善血清、組織中的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞和組織完整性。

炎癥因子在結(jié)腸炎的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[20-21]。TNF-α 由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，能夠在炎癥部位通過調(diào)控白細(xì)胞聚集，刺激單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)病理性損傷[22]；而IL-6 與炎性腸病患者免疫應(yīng)答關(guān)系密切，活化的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及上皮細(xì)胞分泌IL-6 進(jìn)入血液和細(xì)胞間隙后，可激活STAT-3/NF-κB/ICAM-1 通路，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[23-24]。當(dāng)采用外源性因子細(xì)菌脂多糖（LPS）刺激SD 大鼠時(shí)，中性粒細(xì)胞被激活并促進(jìn)溶酶體酶活性和吞噬作用，白細(xì)胞在炎癥局部聚集并刺激單核-巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。在本研究中，當(dāng)SD 大鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）時(shí)，血清和結(jié)腸組織中TNF-α、IL-6 水平顯著升高，結(jié)腸組織的HE 染色和TUNEL染色結(jié)果可見明顯的病理性損傷，表明LPS 誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸炎模型建立成功。而給與HEpep 后血清和結(jié)腸組織中炎癥因子水平顯著下降，結(jié)腸組織的病理性損傷減輕，其中高劑量HEpep 改善效果更加明顯，表明HEpep 可有效緩解LPS 所致結(jié)腸炎癥反應(yīng)。

綜上所述，蛋清蛋白短肽（HEpep）能夠通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而改善由細(xì)菌內(nèi)毒素LPS 誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎。