左小博，孔俊豪，楊秀芳*，房 升，彭新玲，譚 蓉，蘇小琴，刁春華

（1 中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院 杭州 310016 2 浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310016 3 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州 310018）

茶多酚（Tea polyphenol，TP）因其優(yōu)異的抗氧化抑菌性能及綠色天然屬性，并兼具健康功效等特點(diǎn)而被廣泛研究[1-3]。然而，TP 穩(wěn)定性差，體系相容性不佳等問(wèn)題限制了其應(yīng)用[4]。在光照及氧氣等因素影響下，TP 易被氧化成鄰醌類(lèi)及聯(lián)苯酚醌類(lèi)物質(zhì)[5]。Song 等[6]研究發(fā)現(xiàn)25 ℃下TP 的檸檬酸緩沖液在24 h 后降解率達(dá)83%。增強(qiáng)TP 體系穩(wěn)定性，充分發(fā)揮其活性功效是拓展茶多酚應(yīng)用領(lǐng)域的關(guān)鍵[7]。兒茶素類(lèi)化合物作為T(mén)P 功效得以體現(xiàn)的關(guān)鍵組分，占TP 總量的65%～80%，而表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯【 （-）-Epi-gallocatechin-3-gallate，EGCG】 又是兒茶素類(lèi)化合物中的典型代表，占兒茶素總量的50%～80%，是一類(lèi)最為重要的酯型兒茶素[8]。EGCG 與產(chǎn)品基質(zhì)的不相容性，使其活性功效大幅降低。研究發(fā)現(xiàn)[9]，EGCG 可與產(chǎn)品基質(zhì)中的脂質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致其難以作用于目標(biāo)微生物。以EGCG 為研究對(duì)象，著力突破TP 穩(wěn)定性差，體系相容性不佳的應(yīng)用瓶頸，具有研究的可操作性及產(chǎn)業(yè)的可應(yīng)用性[10]。

目前，微膠囊化作為改善EGCG 穩(wěn)定性和相容性的傳統(tǒng)方法已有較多研究，而獲得的產(chǎn)品理化性狀無(wú)法精確控制且在應(yīng)用穩(wěn)定性均存不足[11]。借助化學(xué)修飾可制備脂溶性良好的茶多酚，然而，因分子改性的安全性、有機(jī)溶劑殘留等問(wèn)題而限制了化學(xué)改性EGCG 的應(yīng)用。近年來(lái)，微納米包載技術(shù)作為提高EGCG 穩(wěn)定性的技術(shù)手段得到廣泛關(guān)注。Goncalves 等[12]用麥芽糊精和阿拉伯膠制備裝載EGCG 的納米粒，提高了產(chǎn)品抗氧化活性。Zagury 等[13]制備的EGCG 微納米體不僅有利于多酚的保護(hù)和釋放，而且增強(qiáng)了EGCG 在不同pH 值下的穩(wěn)定性，提高了其生物能效。Shpigelman等[14]通過(guò)熱誘導(dǎo)法制備乳球蛋白-EGCG 納米粒，顯著抑制了EGCG 降解，持續(xù)延長(zhǎng)EGCG 抗氧化活性發(fā)揮時(shí)間。如何進(jìn)一步提高EGCG 負(fù)載率，更好地發(fā)揮功效是其高值化應(yīng)用的關(guān)鍵[15]。

分子自組裝是分子間通過(guò)氫鍵、疏水相互作用、范德華力等作用力自發(fā)形成有序空間結(jié)構(gòu)聚集體的過(guò)程，具有工藝綠色，不使用化學(xué)交聯(lián)劑，操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)[16]。近年來(lái)，分子自組裝已成為天然活性成分包封載運(yùn)及納米體系構(gòu)建和應(yīng)用領(lǐng)域的重要研究課題[17]。分子自組裝不僅賦予活性大分子特殊的結(jié)構(gòu)功能（例如良好的穩(wěn)定性），而且構(gòu)筑新型納米結(jié)構(gòu)體體系相容性高，在活性成分的靶向遞送和控釋緩釋?xiě)?yīng)用方面前景廣闊[18]。

蛋白質(zhì)作為生物大分子，因優(yōu)良的生物相容性、低抗原性等優(yōu)點(diǎn)在載運(yùn)多酚方面應(yīng)用潛力巨大[19]。研究證實(shí)，在特定反應(yīng)條件下植物多酚的多元化酚羥基基團(tuán)與蛋白三維空間結(jié)構(gòu)相互作用可形成穩(wěn)態(tài)化微納米聚集體[20]。然而，兩者直接形成的微納米體系粒徑分布通常相對(duì)離散、裝載率較低且易絮凝分層。pH 變換被認(rèn)為是改善蛋白結(jié)構(gòu)和功能的安全方法，能進(jìn)一步提高活性成分負(fù)載率[21]。Jiang 等[22]研究表明，pH 變換可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)解折疊，使大豆分離蛋白疏水基團(tuán)內(nèi)卷，功能特性增強(qiáng)。pH 堿性處理則能使蛋白結(jié)構(gòu)開(kāi)展，增加其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和界面穩(wěn)定性[23]。酪蛋白（Casein，CS）等富脯氨酸蛋白（Proline-rich-proteins，PRPs）分子具有解聚和自組裝特性，能增強(qiáng)酚羥基和苯環(huán)結(jié)構(gòu)疏水性，裝載后的活性小分子不會(huì)完全包封于蛋白分子通道內(nèi)部空腔[24]。本課題組之前的試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，pH 變換處理能顯著改善CS 在親水體系中的溶解性，有利于活性成分裝載率的提高。

基于此，本研究首先通過(guò)pH 變換結(jié)合超聲同步熱誘導(dǎo)對(duì)CS 改性處理，采用物理誘導(dǎo)的CS為載體封裝EGCG，結(jié)合渦旋孵育建立自組裝模型構(gòu)建EGCG 納米粒體系，以提高其體系穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)茶葉酚類(lèi)的高值化利用和相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，也為植物多酚產(chǎn)業(yè)更好地發(fā)展提供理論和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

EGCG（純度98%），中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院提供；殼聚糖（Chitosan，CTS），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酪蛋白（CS），甘肅華羚乳品股份有限公司；水系濾膜（0.45 μm），天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；透析袋 （MWCO=12 000～14 000），賽默飛世爾科技公司；其它化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

Zetasizer Nano ZS90 納米粒度分布儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；UV-2102PC 型分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；XH-C 旋渦混合器，金壇市醫(yī)療儀器廠；BT100-2J 精密恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司；78HW-1 數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，杭州儀表電機(jī)有限公司；SHH-SDT 綜合藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱，重慶市永生實(shí)驗(yàn)儀器廠；SU8010 型場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SEM），日本HITACHI公司；ALPHA 1-2 LD plus 冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ 公司；DSC 8000 差示掃描量熱儀，美國(guó)珀金埃爾默儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CS-EGCG-CTS 納米粒制備及工藝優(yōu)化[25]

1）溶液配制 以蒸餾水作溶劑制備1 mg/mL的EGCG 溶液，溶解后于4 ℃儲(chǔ)存待用。取CTS 溶于體積分?jǐn)?shù)1%乙酸水溶液，超聲空化處理20 min至澄清透明，室溫磁力攪拌1 h 制得1 mg/mL 溶液，4 ℃儲(chǔ)存待用。

以0.01 mol/L pH=7.4 的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）作溶劑配制1 mg/mL CS 溶液，用1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至pH=12，800 r/min 磁力攪拌1 h，增強(qiáng)其分子內(nèi)作用力，使其形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和乳化特性，再用1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 值至7，800 r/min 磁力攪拌1 h，增加蛋白韌性，改善蛋白的界面穩(wěn)定性和親水性，并于超聲條件下（200 Hz，20 min）分散調(diào)節(jié)pH 值至8.0，4 ℃儲(chǔ)存待用[26]。

2）渦旋孵育 用微量恒流泵以10 mL/min 流速將EGCG 溶液滴加處于600 r/min 渦旋狀態(tài)下的CS 溶液中，將混合溶液于30 ℃、600 r/min 條件下渦旋孵育5 h。所得混合液與另一相（CTS）溶液分別過(guò)0.45 μm 濾膜。使用微量恒流泵按一定體積比將CTS 溶液滴加于500 r/min 渦旋狀態(tài)的CS-TP 溶液體系，室溫下以800 r/min 攪拌12 h得CS-EGCG-CTS 納米體系。

3）考察單個(gè)因素的變化 CS 溶液體積比（1∶0，9∶1，7∶1，5∶1，3∶1）、CTS 質(zhì)量濃度（0，1，3，5，7，9 mg/mL）、EGCG 質(zhì)量濃度 （1，3，5，7，9 mg/mL）、CS 質(zhì)量濃度（0，1，3，5，7，9 mg/mL）。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以粒徑、Zeta 電位、多分散系數(shù)（PDI）等為穩(wěn)定性考察指標(biāo)，對(duì)比分析得較優(yōu)的CSEGCG-CTS 納米體系制備參數(shù)，并采用同等方法制備不含CTS 的CS-EGCG 二元納米粒體系。

1.2.2 不同因素對(duì)CS-EGCG-CTS 納米粒體系穩(wěn)定性影響[27]

1.2.2.1 pH 值對(duì)體系穩(wěn)定性影響 按較優(yōu)條件制備的CS-EGCG-CTS 納米體系等分相同等份，用1 mol/L HCl 將體系pH 分別調(diào)節(jié)至pH=3，4，5，6，7，8，并保持500 r/min 磁力攪拌15 min，稀釋后測(cè)定粒徑及Zeta 電位。

1.2.2.2 離子濃度對(duì)體系穩(wěn)定性影響 將按較優(yōu)條件制備的CS-EGCG-CTS 納米體系，分別用0，20，50，100，200，300 mmol/L NaCl 溶液稀釋?zhuān)瑴y(cè)定粒徑及Zeta 電位。

1.2.3 CS-EGCG-CTS 體系貯存穩(wěn)定性 分別將對(duì)照EGCG 溶液（質(zhì)量濃度3 mg/mL）、CS-EGCG、CS-EGCG-CTS 納米體系置于25 ℃避光密閉條件下貯存，在預(yù)定時(shí)間點(diǎn)測(cè)定樣品粒徑及電位等性質(zhì)。

1.2.4 CS-EGCG-CTS 納米粒冷凍干燥 分別將CS-EGCG-CTS 和CTS-EGCG 納米溶液體系離心（6 000×g、15 min），過(guò)0.45 μm 的微孔濾膜。添加適量保護(hù)劑吐溫80 后，于0.01 MPa，-50 ℃條件冷凍干燥48 h 至水分含量低于7%，即得不同EGCG納米粒。

1.2.5 掃描電鏡（SEM）微觀形貌觀察 通過(guò)SEM對(duì)2 種EGCG 納米粒及EGCG 空白的微觀形貌表征。將樣品用導(dǎo)電膠帶固定于樣品臺(tái)上，經(jīng)噴金處理后，裝入掃描電鏡觀察室，在低電壓下觀察拍照。

1.2.6 包封率、裝載率及多酚保留率的測(cè)定[28]納米粒體系用水復(fù)溶10 倍，12 000 r/min 離心30 min，根據(jù)GB/T 8313-2018 《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》 所述方法計(jì)算游離EGCG 含量[29]，根據(jù)下式計(jì)算包封率（ER）和裝載率（LR）。

1.2.7 粒徑、PDI 和Zeta 電位測(cè)定 取適量EGCG納米體系懸浮液，通過(guò)納米粒度分布儀在25 ℃下測(cè)定其粒徑、PDI 和Zeta 電位，每個(gè)樣品重復(fù)3 次測(cè)定。

1.2.8 差示掃描量熱（DSC）測(cè)定熱力學(xué)性質(zhì) 取10 mg EGCG 納米粒樣品于DSC 測(cè)量池中，以空DSC 測(cè)量池作參比，掃描溫度從30 ℃到230 ℃，升溫速率10 ℃/min，達(dá)到230 ℃后恒溫5 min，降溫至30 ℃。利用配套分析軟件Pyris Software 從熱流曲線分析得到熱力學(xué)參數(shù)。

1.2.9 CS-EGCG-CTS 納米粒體外釋放動(dòng)力學(xué)[17]取CS-EGCG-CTS 納米粒樣品600 mg 分散于5 mL 去離子水中，置于透析袋 （MWCO=12 000～14 000），將透析袋置于盛有溶出介質(zhì)的500 mL燒杯中，在水浴恒溫磁力攪拌器中進(jìn)行釋放實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)速500 r/min，溫度為（25±0.5）℃。在特定時(shí)間點(diǎn)取 樣（0.5，1，2.5，5，11，15，26，35，48，62，74，90 h）按GB/T 8313-2018 《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》方法處理后在波長(zhǎng)765 nm 處測(cè)定溶出介質(zhì)吸光度（A），并補(bǔ)充相應(yīng)量的溶出介質(zhì)[29]。為保證實(shí)驗(yàn)的可比性，以TP（多酚含量40%）作測(cè)定空白對(duì)照，以吸光度（A）對(duì)時(shí)間繪制釋放特性曲線。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析 每組試驗(yàn)平行測(cè)定3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，P＜0.05 表示具有顯著性差異。通過(guò)Microsoft Office Execl 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用OriginPro 9.0.0 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)CS-EGCG-CTS 納米粒體系穩(wěn)定性的影響

2.1.1 CS 溶液體積比對(duì)EGCG 納米體系穩(wěn)定性的影響 穩(wěn)定性表征對(duì)于納米體系性能研究至關(guān)重要，而粒徑和電位作為影響納米體系穩(wěn)定性的重要因素研究廣泛。有研究表明，粒徑小且分布集中的體系具有較佳穩(wěn)定性，在貯存過(guò)程不易分層，其主要原因可能在于較大粒徑微粒的體系因其自身電荷作用及重力沉降而易相互聚集，影響體系穩(wěn)定性[30]。研究體系粒徑、Zeta 電位及PDI 是評(píng)判乳液體系穩(wěn)定性的有效方法，據(jù)此可分析蛋白質(zhì)與多酚等不同成分配比對(duì)納米體系穩(wěn)定性的影響，制備具有較佳性能的EGCG 納米粒體系，并具有操作簡(jiǎn)便，快速靈敏的特點(diǎn)。

CS 溶液體積比對(duì)納米體系粒徑和電位影響見(jiàn)表1。體系粒徑隨著CS 溶液的添加而顯著降低（P＜0.05），之后趨于穩(wěn)定，其原因可能在于CS 作為含有高比例脯氨酸殘基的蛋白質(zhì)（Proline-richproteins，PRPs）能夠與EGCG 相互結(jié)合形成三元復(fù)合體，對(duì)EGCG 具有裝載包封作用，使得粒徑先降低后保持基本穩(wěn)定。Zeta 電位作為表征微納米混合體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，較高的Zeta 電位使不同微粒間空間排斥力增加，不易相互聚集，從而更有利于增強(qiáng)體系穩(wěn)定性[31]。體系Zeta 電位隨CS溶液體積比變化的變化幅度較小，表明體系穩(wěn)定性較好。當(dāng)CTS-EGCG 與CS 比例按5∶1 比例混合后，體系粒徑及Zeta 電位均達(dá)最小，此時(shí)多分散系數(shù)（PDI）也達(dá)最?。?.368）。

表1 CS 溶液體積比對(duì)納米體系粒徑和電位影響Table 1 Effect of volume ratio of CS on the particle size and Zeta potential of nanoemulsion

2.1.2 CS 溶液體積比對(duì)EGCG 納米粒體系包封率及裝載率的影響 CS 溶液體積比對(duì)EGCG 納米體系包封率及裝載率影響見(jiàn)表2。體系中EGCG包封率及裝載率均隨CS 溶液體積比的增加而增大。添加CS 后，納米粒裝載率及包封率分別提高3.09 μg/mg 和1.2%。而當(dāng)CTS-EGCG∶CS 為3∶1時(shí)，包封率和裝載率均達(dá)最大，分別為93.80%和312.53 μg/mg。其原因可能是CS 作為含有高比例脯氨酸殘基的蛋白質(zhì)與多酚具有強(qiáng)親和力和更高結(jié)合率，以及具有開(kāi)放柔性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)適于多酚成分的包封和保護(hù)[32]。

表2 CS 溶液體積比對(duì)EGCG 納米體系包封率及裝載率影響Table 2 Effect of volume ratio of CS on the encapsulation rate and loading rate of EGCG nanoparticles

2.1.3 CTS 質(zhì)量濃度對(duì)EGCG 納米粒體系穩(wěn)定性的影響 CTS 質(zhì)量濃度對(duì)納米體系粒徑和電位的影響見(jiàn)圖1。隨著CTS 質(zhì)量濃度增加，粒徑顯著性（P＜0.05）增加，從84.55 nm 增加至685.07 nm，同時(shí)體系Zeta 電位也逐步增大，從36.50 mV 增加至64.60 mV，表明體系穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。當(dāng)CTS 質(zhì)量濃度大于1 mg/mL 后體系Zeta 電位變化趨于平穩(wěn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著CTS 質(zhì)量濃度增加體系顏色逐漸加深，透光性降低，PDI 呈先增后降趨勢(shì)。

圖1 CTS 質(zhì)量濃度對(duì)納米體系粒徑和電位的影響Fig.1 Effect of CTS mass concentration on the particle size and Zeta potential of nanoemulsion

2.1.4 EGCG 質(zhì)量濃度對(duì)EGCG 納米粒體系穩(wěn)定性的影響 EGCG 質(zhì)量濃度對(duì)納米體系粒徑和電位影響見(jiàn)圖2。隨著EGCG 質(zhì)量濃度增加，體系粒徑呈先降低后升高趨勢(shì)（P＜0.05），從239.30 nm 變化至301.33 nm。有研究指出[33]，較低濃度的多酚類(lèi)物質(zhì)能與蛋白相互作用形成可溶性復(fù)合體，而高濃度的多酚能夠?qū)е碌鞍拙奂恋?。?dāng)EGCG質(zhì)量濃度為3 mg/mL 時(shí)，體系具有最小粒徑（156.07 nm）和Zeta 電位（14.93 mV），之后逐步增大。其原因可能在于多酚和蛋白質(zhì)的靜電結(jié)合改變了蛋白質(zhì)分子表面所帶電荷的密度，導(dǎo)致蛋白分子之間的吸附聚集[30]。隨著EGCG 質(zhì)量濃度增大包封的納米粒接近飽和，繼續(xù)增加EGCG 質(zhì)量濃度，多余的EGCG 易吸附于納米粒表面，同時(shí)顆粒之間易相互聚集，一定程度增大了微粒平均粒徑。

圖2 EGCG 質(zhì)量濃度對(duì)納米體系粒徑和電位的影響Fig.2 Effect of EGCG mass concentration on the particle size and Zeta potential of nanoemulsion

黃煒超等[32]研究發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG 質(zhì)量濃度增大，與酪蛋白酸鈉結(jié)合的EGCG 分子越多，而EGCG 作為多齒狀配基能繼續(xù)與復(fù)合物發(fā)生結(jié)合形成二聚體或多聚體，使得體系粒徑進(jìn)一步增大，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

2.1.5 CS 質(zhì)量濃度對(duì)EGCG 納米粒體系穩(wěn)定性的影響 CS 質(zhì)量濃度對(duì)納米體系粒徑和電位影響見(jiàn)圖3。由圖可知，當(dāng)添加CS 后，體系粒徑從792.5 nm 降低到173.4 nm。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著CS 質(zhì)量濃度的增加體系粒徑逐步增加，體系顏色也逐漸加深，透光性降低，PDI 逐漸降低，表明體系粒徑分布趨于均一。體系Zeta 電位隨CS 質(zhì)量濃度變化較小，表明體系穩(wěn)定性較強(qiáng)。隨著CS 濃度增加，EGCG 與蛋白分子吸附碰撞使得體系粒徑逐漸增大。

圖3 CS 質(zhì)量濃度對(duì)納米體系粒徑和電位的影響Fig.3 Effect of CS mass concentration on the particle size and Zeta potential of nanoemulsion

通過(guò)分析各因素對(duì)試驗(yàn)的影響，在CTS 質(zhì)量濃度3 mg/mL，CS 質(zhì)量濃度1 mg/mL、EGCG 質(zhì)量濃度3 mg/mL，CTS-EGCG 與CS 按照5∶1 體積比混合條件下制備的EGCG 納米粒，基本性能已較為穩(wěn)定，作為較優(yōu)方案制備的產(chǎn)品平均粒徑（173±5）nm，Zeta 電位（60±1.2）mV，樣品體系具有較佳穩(wěn)定性且裝載率較高。

2.2 不同因素對(duì)EGCG 納米粒體系穩(wěn)定性的影響

離子濃度及pH 對(duì)EGCG 納米體系粒徑和電位影響見(jiàn)圖4。隨著離子濃度增大，納米粒體系粒徑先減小后增大，在離子濃度50 mmol/L 時(shí)，體系粒徑達(dá)最小163.23 nm，PDI 為0.22。隨著離子濃度增大，體系Zeta 電位逐漸降低，在300 mmol/L時(shí)電位達(dá)最?。?2.63 mV）。不同離子能夠在蛋白表層形成靜電作用吸附層，而離子濃度對(duì)蛋白質(zhì)的影響具體取決于蛋白表層電荷和性質(zhì)[34]。侯紹云等[35]研究發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl 濃度增加，納米粒子粒徑逐漸增大，分散呈不均勻狀態(tài)，粒子表面電荷逐漸減小，這與本文研究結(jié)果基本一致。

圖4 離子濃度及pH 值對(duì)EGCG 納米體系粒徑和電位的影響Fig.4 Effect of ion concentration and pH value on the particle size and Zeta potential of EGCG nanoemulsion

隨著pH 值增加，納米粒體系粒徑逐步增大，當(dāng)pH＞6 時(shí)粒徑大幅增加，當(dāng)pH=8 時(shí)體系具有最大粒徑1 908.33 nm。酸性條件下，質(zhì)子化作用使得分子間斥力減弱，使得粒子間吸引力大于斥力，粒徑較小。有研究稱(chēng)[33]，酸性條件下酪蛋白呈閉合構(gòu)象，其疏水結(jié)構(gòu)分布于內(nèi)部，隨著pH 值逐步增加，蛋白分子結(jié)構(gòu)內(nèi)的疏水基團(tuán)逐漸暴露，從而與活性小分子如多酚等結(jié)合使粒徑增大。Zeta 電位隨pH 增加而降低，在pH 大于6 之后大幅降低，兩者呈相反變化趨勢(shì)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著pH 值增加體系顏色逐漸加深，在pH=8 時(shí)體系出現(xiàn)明顯沉淀，表明酸性條件下體系穩(wěn)定性較好，而在堿性條件下穩(wěn)定性較差。離子表面電荷是維持體系穩(wěn)定的重要因素，有研究發(fā)現(xiàn)，偏堿性條件下多酚類(lèi)成分羥基易發(fā)生質(zhì)子化，使納米粒負(fù)電荷增多，結(jié)合作用增強(qiáng)，在粒子間靜電排斥力及自身重力作用下，納米粒粒徑增大[33，36]。

2.3 EGCG 納米粒體系貯存穩(wěn)定性分析

由于分子微粒的布朗運(yùn)動(dòng)及重力等作用，納米粒體系在貯存過(guò)程中粒徑、Zeta 電位及PDI 等指標(biāo)會(huì)產(chǎn)生變化，通常有微粒聚集、絮凝甚至分層等常見(jiàn)失穩(wěn)現(xiàn)象的發(fā)生。貯存過(guò)程中EGCG 納米粒體系Zeta 電位、PDI 和粒徑隨時(shí)間的變化見(jiàn)圖5。貯存過(guò)程中，EGCG 溶液粒徑、Zeta 電位、PDI均隨時(shí)間呈顯著性變化（P＜0.05），而制備的CSEGCG-CTS 納米粒體系穩(wěn)定性顯著提高，Zeta 電位、粒徑、PDI 均未呈現(xiàn)明顯變化（P＞0.05），體系均一性和穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。結(jié)果表明，以物理改性CS 結(jié)合CTS 對(duì)EGCG 穩(wěn)態(tài)化修飾封裝載運(yùn)，能實(shí)現(xiàn)EGCG 體系穩(wěn)定性的顯著提高。

圖5 貯存過(guò)程中EGCG 納米粒體系PDI、Zeta 電位和粒徑隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of PDI，Zeta potential and particle size of EGCG nanoemulsion over time during storage

2.4 不同EGCG 納米粒體系粒徑分布隨時(shí)間變化及SEM 外觀形貌比較

不同EGCG 納米體系粒徑分布隨時(shí)間變化見(jiàn)圖6。由圖可知，貯存過(guò)程中，空白對(duì)照EGCG溶液粒徑隨時(shí)間延長(zhǎng)呈顯著性變化，重現(xiàn)性較差且粒徑分布無(wú)規(guī)律，而經(jīng)穩(wěn)態(tài)化改性制備的EGCG 納米粒體系粒徑穩(wěn)定性顯著提高（P＜0.05），隨著時(shí)間延長(zhǎng)重復(fù)性好，表明EGCG 經(jīng)包封改性后其體系穩(wěn)定性增強(qiáng)。

圖6 EGCG 納米粒體系粒徑分布隨時(shí)間變化Fig.6 Changes of particle size distribution of EGCG nanoemulsion with time

不同EGCG 納米粒體系的SEM 微觀形貌見(jiàn)圖7。由圖可知，SEM 結(jié)果顯示研究制備的EGCG 納米粒相比空白EGCG 的微觀形貌有顯著性改變，呈表面不光滑的相互聚集狀態(tài)，聚集后粒徑基本分布于1～3 μm 之間，微粒表面有凹痕，CS-EGCG-CTS 微粒的粒徑趨于均一，結(jié)構(gòu)形態(tài)趨同[37]。

圖7 不同EGCG 納米粒的SEM 微觀形貌圖Fig.7 SEM microscopic morphology of different EGCG nanoparticles

2.5 DSC 熱力學(xué)性質(zhì)

EGCG 納米粒DSC 熱流曲線對(duì)比分析見(jiàn)圖8。由圖可知，空白EGCG 在（119±2.0）℃和（215±2.1）℃分別出現(xiàn)2 個(gè)強(qiáng)吸熱峰，前者可能是由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差向異構(gòu)轉(zhuǎn)變[38]，后一個(gè)吸熱峰對(duì)應(yīng)于EGCG 熔融溫度，此時(shí)有相變發(fā)生[22-23]。對(duì)比可知，CS-EGCG-CTS 納米粒在升溫過(guò)程中，僅在100～150 ℃間出現(xiàn)放熱谷，DSC 熱流曲線變化平穩(wěn)，表明EGCG 經(jīng)包封改性后熱力學(xué)穩(wěn)定性得到增強(qiáng)。

圖8 EGCG 納米粒DSC 熱流曲線分析Fig.8 DSC heat flow curve of EGCG nanoparticles

2.6 CS-EGCG-CTS 納米粒體外釋放動(dòng)力學(xué)

緩釋特性是衡量納米化產(chǎn)物穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，當(dāng)被包封的活性成分從納米粒體系中逐漸釋放后，能夠延長(zhǎng)有效成分的作用時(shí)間，促進(jìn)應(yīng)用功效更好發(fā)揮[36]。CS-EGCG-CTS 納米粒體外緩釋性能曲線見(jiàn)圖9。由圖可知，在11 h 內(nèi)對(duì)照EGCG 的釋放量隨著時(shí)間較快增加，在11 h 后溶出介質(zhì)中多酚含量趨于穩(wěn)定，基本保持不變。11 h 的釋放量占90 h 釋放量的95.9%，表明對(duì)照EGCG 在11 h左右大部分內(nèi)含成分已完成溶出釋放。CSEGCG-CTS 表現(xiàn)出了緩慢逐步釋放特性，11 h 的釋放量占90 h 釋放量的45.2%，在48 h 作用內(nèi)含成分的釋放量才趨于穩(wěn)定，占90 h 釋放量的90.2%。分析其原因，可能在于CS-EGCG-CTS 納米粒中EGCG 被包封于納米粒內(nèi)部，內(nèi)含成分與納米粒子間存在較強(qiáng)分子間作用力，使其表現(xiàn)出較好緩釋特性[39-40]。這表明EGCG 經(jīng)包封改性后，其體外釋放特性得到了改善，有利于應(yīng)用功效的發(fā)揮。

圖9 CS-EGCG-CTS 納米粒體外緩釋性能曲線Fig.9 Sustained release character in vitro of CS-EGCG-CTS nanoparticles

3 結(jié)論

針對(duì)茶葉多酚組分穩(wěn)定性差等限制其應(yīng)用的問(wèn)題，以EGCG 為研究對(duì)象，通過(guò)多極性pH 變換結(jié)合超聲同步熱誘導(dǎo)對(duì)CS 改性以提高其包封載運(yùn)能力，結(jié)合渦旋孵育建立自組裝模型構(gòu)建EGCG 三元納米粒體系，獲得高荷載EGCG 納米粒體系，平均粒徑173 nm，Zeta 電位60 mV，包封率達(dá)90%～95%，裝載率均高于305 μg/mg。體系中EGCG 包封率及裝載率均隨CS 溶液占比的增加而增大，即被包封EGCG 增加同時(shí)體系均勻性和穩(wěn)定性也增強(qiáng)。離子濃度50 mmol/L 時(shí)，體系粒徑達(dá)最小163.23 nm，PDI 分散指數(shù)達(dá)0.22。在酸性條件下納米粒體系具有較好粒徑穩(wěn)定性。相較于對(duì)照，貯存過(guò)程中EGCG 納米粒體系穩(wěn)定性顯著提高，Zeta 電位、粒徑、PDI 均未呈現(xiàn)明顯變化（P＞0.05）。SEM 顯示EGCG 經(jīng)包封后粒徑趨于均一，呈球狀顆粒，相互聚集后粒徑分布于1～3 μm，并具有較好的熱力學(xué)穩(wěn)定性。

本研究采用綠色安全的穩(wěn)態(tài)化修飾手段對(duì)EGCG 包封和保護(hù)，提高了EGCG 的穩(wěn)定性和分散性，在保證EGCG 納米粒較高裝載率及包封率的同時(shí)促進(jìn)了EGCG 體系相容性和應(yīng)用緩釋特性的增強(qiáng)，避免了化學(xué)改性手段所存在的安全風(fēng)險(xiǎn)。與常規(guī)微納米載體技術(shù)相比，多酚負(fù)載量得到提高，能夠作為茶葉酚類(lèi)化合物及其衍生物包封、保護(hù)和遞送系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)活性功效高效發(fā)揮和穩(wěn)態(tài)化應(yīng)用的潛力，從而為其更好地應(yīng)用于食品添加劑綠色制備、靶向藥物、特殊用途食品、高活性日用洗護(hù)產(chǎn)品、環(huán)境改良劑開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域提供理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。