沈敬堃，朱海濤，梅珈彬，潘際剛，王 璐，王旭東

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

在中國(guó)，乳腺癌為女性發(fā)病率最高的癌癥(19.2%)，致死率為9.1%[1]。他莫昔芬是一種人工合成的化合物，其可與雌激素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體而發(fā)揮抗雌激素的作用，常用于雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌的治療，可降低乳腺癌的復(fù)發(fā)率和死亡率，但他莫昔芬的長(zhǎng)期使用產(chǎn)生的獲得性耐藥會(huì)導(dǎo)致療效降低[2]。地高辛(digoxin)是一種源自洋地黃的強(qiáng)心苷，主要用于治療充血性心力衰竭，其作用機(jī)制是抑制Na+/K+-ATP酶[3]。近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道地高辛具有抗癌作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)地高辛可以逆轉(zhuǎn)MCF-7細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性[5]，表明地高辛具有提高其他抗癌藥療效的潛能，然而，地高辛聯(lián)合他莫昔芬對(duì)乳腺癌的增殖和凋亡的影響及其機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。此外，乳腺癌造成的死亡大多與癌細(xì)胞的遷移相關(guān)，而癌細(xì)胞的遷移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesencymal transition，EMT) 密切相關(guān)[6]。目前地高辛對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響以及地高辛和他莫昔芬聯(lián)合用藥是否能協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究測(cè)試了地高辛、紫杉醇、吉西他濱和阿霉素與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用，檢測(cè)地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響，并探索其對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的影響，以期為臨床增強(qiáng)他莫昔芬的療效提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑 DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基(C11995500BT，Gibco)、青霉素-鏈霉素雙抗(J180027)購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)(1913444)購(gòu)自Biological Industries公司；地高辛(HY-B1049)、他莫昔芬(HY-13757A)購(gòu)自MedChemExpress公司，紫杉醇(MB1178)、阿霉素(MB1087)購(gòu)自大連美侖公司，吉西他濱(G8970)、MTT噻唑藍(lán)(M8180)購(gòu)自北京索萊寶公司；細(xì)胞凋亡試劑盒(KGA106)購(gòu)自凱基生物公司；多克隆抗體PI3K(AP0230)、α-tubulin(BS1699)、二抗山羊抗兔(BS13278)、二抗山羊抗鼠(BS12478)購(gòu)自Bioworld公司；多克隆抗體E-cadherin(20874-I-AP)、N-cadherin(22018-I-AP)、Vimentin(10366-I-AP)、caspase-3(66470-2-Ig)、caspase-9(10380-1-AP)、Bcl-2(12789-1-AP)、p-AKT(66444-I-Ig)購(gòu)自Proteintech公司；多克隆抗體AKT(Gb111114)購(gòu)自Servicebio公司，單克隆抗體p-PI3K(17366S)購(gòu)自Cell Signaling公司；Immobilon Western HRP底物(WBKLS0500)購(gòu)自EMD Millipore公司。

1.1.3儀器 恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(2001HY-6003，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司)；超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司)；Epoch型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek 公司)；Novoexpress 流式細(xì)胞儀(美國(guó)艾森生物公司)；多功能成像系統(tǒng)(ChemiDoc MP,美國(guó)Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(Olympus 公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與藥液配置 乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基(高糖，含4.5 g·L-1葡萄糖、10% FBS和1%青霉素-鏈霉素)中，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。他莫昔芬、地高辛、紫杉醇、吉西他濱、阿霉素分別用DMSO配置為10 mmol·L-1的母液。

1.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞(4×103個(gè)/孔) 接種于96孔板，每孔100 μL；培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞貼壁后，分別加入他莫昔芬(0、1、2.5、5、10 μmol·L-1)、地高辛(0、10、15、20、25 nmol·L-1)、紫杉醇(0、100、200、300、400 nmol·L-1)、吉西他濱(0、1、5、10、25 μmol·L-1)、阿霉素(0、1、5、10、25 μmol·L-1)以及上述濃度的他莫昔芬與地高辛、紫杉醇、吉西他濱、阿霉素聯(lián)合用藥，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。各組培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中避光孵育4 h后用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)OD值。細(xì)胞增殖率/% = (試驗(yàn)組OD值-空白組OD值) /(對(duì)照組OD 值-空白組OD 值) × 100%。用金氏公式[7]計(jì)算協(xié)同作用，q=E(A + B) /(EA +(1-EA) ·EB)，其中E(A + B)為藥物聯(lián)合作用的抑制率， EA、EB 分別為單獨(dú)藥物作用組的抑制率，q>1.15為協(xié)同作用，q=0.85-1.15為相加作用，q<0. 85為拮抗作用;實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.3平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7 細(xì)胞(1×103個(gè)/孔) 接種于6孔板中，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱。分為等體積DMSO(對(duì)照組)、他莫昔芬10 μmol·L-1單藥處理組、地高辛10 nmol·L-1單藥處理組和聯(lián)合用藥組，每組3個(gè)復(fù)孔，每組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。待14 d后吸去6孔板中的培養(yǎng)基，用4%的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞30 min，再用結(jié)晶紫常溫下染色30 min，烘箱烤干，拍照，計(jì)數(shù)各組的克隆形成數(shù)。

1.2.4劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至90%-100%融合度，用200 μL槍頭在6孔板底做輕柔劃痕，劃一條豎線和一條橫線，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞2次，將6孔板放在倒置顯微鏡下觀察，在豎線和橫線交界處附近拍照，拍照后加藥，加藥分組為5 μmol·L-1他莫昔芬單藥組、10 nmol·L-1地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組和等體積DMSO對(duì)照組，24 h后在相同的位置再次拍照。使用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，遷移率/%=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。每個(gè)加藥組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基和Matrigel放在4 ℃冰箱預(yù)冷，按培養(yǎng)基：Matrigel=11 ∶1的比例配制基質(zhì)膠，Transwell小室放置于24孔板中，每個(gè)Transwell小室均勻鋪100 μL基質(zhì)膠，放回培養(yǎng)箱中靜置3 h，使其成為膠狀，取出24孔板，棄去上清液后加入PBS，靜置15 min后除去PBS。Transwell上室中加入200 μL細(xì)胞懸液使每個(gè)小室細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè)，下室每孔加入600 μL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加藥分組為5 μmol·L-1他莫昔芬單藥組、10 nmol·L-1地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組和等體積DMSO對(duì)照組，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，吸去上室和下室中的培養(yǎng)基，使用甲醇固定15 min，PBS清洗小室2遍，加入結(jié)晶紫染色30 min，PBS清洗2遍，棉簽輕輕擦去上室中未穿膜的細(xì)胞，放入烘箱烘干，取出置于倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)。每個(gè)加藥組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜，待細(xì)胞完全貼壁后加藥，分為他莫昔芬10 μmol·L-1單藥處理組、地高辛50 nmol·L-1單藥處理組、聯(lián)合用藥組、等體積DMSO對(duì)照組，加藥24 h后，用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，加入5 μL的異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer，Annex V-FITC)和5 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)室溫避光反應(yīng)15 min后進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7Western blot法檢測(cè)PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、caspase-9、cleaved-caspase-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin及tubulin蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞至70%-80%融合度后加藥，采用與劃痕實(shí)驗(yàn)相同的藥物濃度和分組，用以檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白(N-cadherin、E-cadherin和Vimentin)的表達(dá)。采用與流式實(shí)驗(yàn)相同的藥物濃度和分組，用以檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3、cleaved-caspase-3、caspase-9和cleaved-caspase-9)和PI3K-AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT)的表達(dá)，加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入RIPA細(xì)胞裂解液(使用前，先加1%的苯甲基磺酰氟混勻)，放置于冰上裂解20 min，收集含蛋白的裂解液于1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min后取上清液，BCA法定量蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，100 ℃煮5 min。每個(gè)泳道上30 μg蛋白樣品，SDS-PAGE電泳90 min分離蛋白，然后將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜120 min，用5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入PI3K、AKT、p-AKT、Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin(1 ∶1 000)及tubulin(1 ∶20 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST清洗3次(10 min/每次)后再加入相應(yīng)的二抗(1 ∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST清洗3次(10 min/每次)，在膜上均勻滴加曝光液，后曝光顯影。以tubulin作為內(nèi)參蛋白，目的蛋白(PI3K、p-PI3K、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9、N-cadherin、E-cadherin、Vimentin)與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值為其相對(duì)表達(dá)量；p-AKT與AKT灰度值的比值為p-AKT的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 紫杉醇、吉西他濱、阿霉素和地高辛聯(lián)合他莫昔芬對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖的影響MTT結(jié)果(Fig 1)顯示，紫杉醇、吉西他濱、阿霉素、地高辛、他莫昔芬單獨(dú)用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞的活力均有顯著的抑制作用(P<0.05)，經(jīng)金氏公式檢驗(yàn)，各濃度紫杉醇、吉西他濱、阿霉素分別與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用均無(wú)協(xié)同效應(yīng)(q值均小于1.15)，而各濃度的地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用均有明顯的協(xié)同效應(yīng)(q值均大于1.15)。

2.2 地高辛和他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7克隆形成的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 2)顯示，溶劑對(duì)照組、他莫昔芬單藥組、地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組中MCF-7細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(355±9)個(gè)、(237±7)個(gè)、(215±7)個(gè)、(50±4)個(gè)。各用藥組與對(duì)照組相比差異均有顯著性(P<0.05)，藥物聯(lián)合組與各單獨(dú)用藥組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。

2.3 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)MCF-7 細(xì)胞的凋亡的影響流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果(Fig 3)顯示，對(duì)照組、他莫昔芬組、地高辛組和聯(lián)合用藥組的凋亡率分別為(0.58±0.05)%、(1.33±0.08)%、(7.42±0.22)%、(22.59±0.87)%，各用藥組與對(duì)照組相比，差異均有顯著性(P<0. 05)；聯(lián)合用藥組和單藥組相比，差異均有顯著性(P<0.01)。

2.4 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響Western blot結(jié)果(Fig 4)表明，與對(duì)照組相比，他莫昔芬、地高辛和聯(lián)合用藥對(duì)caspase-3、caspase-9無(wú)明顯影響；促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3、cleaved-caspase-9的表達(dá)明顯增多(P<0.05)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，和單獨(dú)用藥組相比，聯(lián)合用藥組的變化更為明顯(P<0.05)。

2.5 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移的影響劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 5)顯示，對(duì)照組、他莫昔芬單藥組、地高辛單藥組、聯(lián)合用藥組的遷移率分別為(80.42±1.46)%、(64.15±1.19)%、(55.93±1.59)%、(31.08±4.17)%。與對(duì)照組相比，他莫昔芬、地高辛單藥組遷移率均明顯下調(diào)(P<0.05)，和單藥組相比，聯(lián)合用藥組遷移率明顯下調(diào)(P<0.05)。

Fig 1 Effects of different concentrations of tamoxifen combined with paclitaxel, gemcitabine, adriamycin and digoxin on proliferation of MCF-7 cells in vitro n=18)

Fig 2 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on cell colonies of MCF-7 cells n=9)

2.6 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲的影響Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Fig 6)顯示對(duì)照組、他莫昔芬單藥組、地高辛單藥組和聯(lián)合用藥組發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)分別為(406.00±9.16)個(gè)、(226.67±11.71)個(gè)、(211.67±10.59)個(gè)、(54.33±4.04)個(gè)。與對(duì)照組相比，單藥組侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著下調(diào)(P<0.01)，與單藥組相比，聯(lián)合用藥組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯下調(diào)(P<0.01)。

Fig 3 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on apoptosis of MCF-7 cells n=3)

2.7 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白水平的影響Western blot結(jié)果(Fig 7)表明，與對(duì)照組相比，間質(zhì)表型指標(biāo)蛋白N-cadherin和Vimentin的表達(dá)明顯減少，上皮表型指標(biāo)蛋白E-cadherin的表達(dá)均明顯增多(P<0.05)，與單藥組對(duì)比，聯(lián)合用藥組的變化更為明顯(P<0.05)。

2.8 地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)PI3K-AKT信號(hào)通路的影響Western blot結(jié)果(Fig 8)顯示，和對(duì)照組對(duì)比他莫昔芬、地高辛和聯(lián)合用藥對(duì)AKT的表達(dá)無(wú)明顯影響，PI3K、p-PI3K和p-AKT的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與單藥組對(duì)比，聯(lián)合用藥組的變化更為明顯(P<0.01)。

Fig 4 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on expression of Bax, Bcl-2, caspase-3, cleaved-caspase-3, caspase-9 and cleaved-caspase-9 proteins in MCF-7 cells detected by Western blot n=3)

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，大約有70%的乳腺癌是雌激素受體陽(yáng)性的[8]。他莫昔芬是雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌最常用的內(nèi)分泌治療藥物，可降低乳腺癌的復(fù)發(fā)率和死亡率，但乳腺癌細(xì)胞對(duì)他莫昔芬的耐藥性，成為降低他莫昔芬治療效果的主要原因之一[2]。因此有必要尋求增強(qiáng)他莫昔芬療效的方法，近年已有研究表明法他斯汀(Fatostatin)和沒食子酸月桂酯(Lauryl Gallate)等藥物與他莫昔芬聯(lián)合應(yīng)用可以有效提高他莫昔芬的療效[9-10]。因此，他莫昔芬與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用可能成為提高療效的一種可行方法。

有研究發(fā)現(xiàn)服用地高辛的心臟病患者癌癥發(fā)病率降低，Na+/K+-ATP酶抑制劑可以在前列腺癌、乳腺癌、肺癌和白血病等疾病中發(fā)揮抗癌作用，一些Na+/K+-ATP酶抑制劑已在臨床前研究和臨床研究中發(fā)揮了很強(qiáng)的抗癌活性，這些結(jié)果表明了Na+/K+-ATP酶可能在腫瘤發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，其抑制劑的抗癌活性值得研究[11]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)地高辛可與順鉑和阿霉素等抗癌藥協(xié)同作用[12-13]，表明地高辛具有增強(qiáng)其他抗癌藥物療效的潛在價(jià)值。

Fig 5 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on migration of MCF-7 cells using wound healing assay n=9)

Fig 6 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on invasion of MCF-7 cells using transwell assay n=9)

Fig 7 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on expression of N-cadherin, E-cadherin and vimentin proteins in MCF-7 cells detected by Western blot n=3)

Fig 8 Effect of tamoxifen, digoxin and combination treatment on expression of PI3K, p-PI3K, AKT and p-AKT proteins in MCF-7 cells detected by Western blot n=3)

本研究通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了紫杉醇、吉西他濱、阿霉素和地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響，MTT結(jié)果經(jīng)金氏公式驗(yàn)證，不同濃度的他莫昔芬與不同濃度紫杉醇、吉西他濱和阿霉素聯(lián)合用藥均無(wú)明顯的協(xié)同作用，而不同濃度的他莫昔芬與不同濃度的地高辛聯(lián)合用藥對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用均大于兩者單用之和，具有較明顯的協(xié)同作用。進(jìn)一步細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)觀察確證了他莫昔芬聯(lián)合地高辛能協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞的增殖活動(dòng)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在生理或病理?xiàng)l件下發(fā)生的自發(fā)的、程序性的死亡，它受到多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。有研究表明，PI3K-Akt信號(hào)通路在乳腺癌中異?；罨痆14]，而PI3K-Akt信號(hào)通路可以通過(guò)多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，其主要途徑有：促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，阻止Bax的活化而降低其促凋亡作用[15]。在應(yīng)激刺激下，細(xì)胞的凋亡取決于抗凋亡的Bcl-2和促凋亡的Bax的比例，有利于凋亡的蛋白失衡將導(dǎo)致線粒體膜通透性的增加、細(xì)胞色素C的釋放，caspase的活化[16]。本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，地高辛與他莫昔芬可以協(xié)同誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞的凋亡；Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥可以協(xié)同抑制PI3K蛋白表達(dá)和PI3K、AKT蛋白磷酸化，同時(shí)協(xié)同促進(jìn)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)及caspase-3/9活化，并協(xié)同抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，這與流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，提示地高辛可以協(xié)同他莫昔芬促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這可能是減少細(xì)胞增殖的重要原因。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道地高辛可下調(diào)雌激素受體[17]，這可能與地高辛顯著增強(qiáng)他莫昔芬療效相關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

乳腺癌的轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者生存的主要威脅之一，乳腺癌的轉(zhuǎn)移和EMT密切相關(guān)，EMT過(guò)程促進(jìn)N-cadherin、vimentin等蛋白的表達(dá)，抑制E-cadherin等蛋白的表達(dá)[18]。目前，地高辛與其他抗癌藥聯(lián)合應(yīng)用抑制癌細(xì)胞的增殖的研究較多，但關(guān)于地高辛聯(lián)合其他抗癌藥對(duì)癌癥細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT的作用的研究較少。本研究通過(guò)劃痕愈合和Transwell小室實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)地高辛與他莫昔芬在較低濃度的聯(lián)合用藥可在不明顯影響細(xì)胞活性的前提下，協(xié)同抑制MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力。與劃痕愈合及Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)地高辛與他莫昔芬聯(lián)合用藥可協(xié)同抑制間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白N-cadherin和vimentin的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，提示地高辛與他莫昔芬可協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞EMT。

綜上所述，地高辛可以協(xié)同他莫昔芬通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)通路，誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡、抑制增殖。此外，地高辛與他莫昔芬在較低濃度時(shí)，可通過(guò)抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的EMT而抑制遷移和侵襲。