李 浩，關(guān)艷玲，張 雨，劉 倩，魏 偉，馬 旸

(安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽抗炎免疫藥物協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽 合肥 230032)

原發(fā)性膽汁性膽管炎(primary biliary cholangitis，PBC)是一種慢性膽汁淤積性肝病，其特征是肝內(nèi)小膽管的破壞，疾病最終可進(jìn)展為肝纖維化和潛在的肝硬化。目前，PBC發(fā)病原因尚未明確，可能由環(huán)境、細(xì)菌感染、基因等諸多因素引起。人群中年發(fā)病率為 0.9-5.8人/10萬(wàn)人，92%的患者為女性,目前除部分晚期患者接受肝臟移植外，針對(duì)PBC中早期的治療手段有限。目前FDA僅批準(zhǔn)了兩種治療藥物——熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)和奧貝膽酸(obeticholic acid，OCA)，但約有40%的患者對(duì)UDCA無(wú)應(yīng)答[1]。因此，研究PBC的發(fā)病機(jī)制、尋找藥物的作用靶點(diǎn)對(duì)于開(kāi)發(fā)治療PBC的藥物十分重要。動(dòng)物模型是闡述人類(lèi)疾病病因和病理機(jī)制、開(kāi)發(fā)治療藥物的重要工具，對(duì)于PBC的發(fā)病機(jī)制的探索以及藥物的研發(fā)有著重要意義。本文綜述了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外報(bào)道的PBC動(dòng)物模型研究進(jìn)展以及各種模型在疾病研究中的應(yīng)用，為PBC模型的選擇提供參考。

1 PBC的發(fā)病機(jī)制

PBC的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，受遺傳易感性、環(huán)境因素及免疫耐受異常的影響。在遺傳易感性方面,人類(lèi)白細(xì)胞抗原和白介素-12在PBC的發(fā)生中起重要作用；環(huán)境因素可通過(guò)分子模擬打破機(jī)體對(duì)線粒體抗原的自身耐受, 啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)；機(jī)體的免疫耐受缺失(如T細(xì)胞、B細(xì)胞的免疫調(diào)控失衡)，可導(dǎo)致膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelia cell，BEC)損傷。

自身抗體在PBC的發(fā)病中可能起著關(guān)鍵的作用，也是PBC的臨床診斷的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。在PBC的發(fā)生過(guò)程中，巨噬細(xì)胞吞噬抗原，提呈給T細(xì)胞，T細(xì)胞分化成效應(yīng)T細(xì)胞并產(chǎn)生一系列的細(xì)胞因子，同時(shí)B細(xì)胞在效應(yīng)T細(xì)胞的輔助下，增殖分化為漿母細(xì)胞，最終分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生一系列的抗體，其中包括特異性自身抗體——抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody，AMA)。AMA是PBC的特征性自身抗體,見(jiàn)于95%以上的PBC患者, 且隨著檢測(cè)技術(shù)的提高, AMA的陽(yáng)性檢出率也明顯升高,但目前認(rèn)為其水平高低與疾病嚴(yán)重程度關(guān)系不大。此外，1/3以上的PBC患者可檢出抗核抗體(antinuclear antibody，ANA), 其中抗gp210、p62、sp100、PML等抗核抗體對(duì)診斷AMA陰性的PBC患者具有較高的診斷價(jià)值，可能與疾病的預(yù)后有關(guān)[2]。

T細(xì)胞在PBC的發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用，自身反應(yīng)性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞被認(rèn)為是參與PBC的主要機(jī)制之一，此前的研究發(fā)現(xiàn)PBC患者受損膽管周?chē)嬖诖罅恐虏⌒訡D4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，并且證實(shí)CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞是主要的致病因素。其中，PBC患者肝組織炎癥部位中浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞主要是CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞是患者膽管破壞的效應(yīng)細(xì)胞[3]，主要通過(guò)表達(dá)FasL及分泌穿孔素和顆粒酶B引起B(yǎng)EC的凋亡。輔助性T細(xì)胞(T helper cell, Th)的活化是自身免疫病的重要致病機(jī)理之一，有報(bào)道稱(chēng)，Th 17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)比例失衡，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫病中起著關(guān)鍵作用[4]，而PBC患者中Treg數(shù)量下降, Th17細(xì)胞數(shù)量增高, 打破兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡, 維持自身免疫應(yīng)答的穩(wěn)態(tài)遭到破壞,可能是引發(fā)PBC病癥的原因。

PBC患者的血清B淋巴細(xì)胞活化因子水平相比健康人群及丙型肝炎患者均顯著升高, 并且PBC的肝臟組織亦可見(jiàn)B細(xì)胞浸潤(rùn)。提示B淋巴細(xì)胞可能在PBC的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，但其具體的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。研究表明[5]，采用利妥昔單抗(rituximab)耗竭B細(xì)胞，可以顯著減少B細(xì)胞所產(chǎn)生的AMA，降低血清AMA滴度，同時(shí)降低血漿免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)的水平以及堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的水平，提示耗竭B細(xì)胞可能成為治療PBC的新靶點(diǎn)。

自然殺傷細(xì)胞(nature killer cell, NK)和自然殺傷性T細(xì)胞(nature killer T cell，NKT)與PBC的發(fā)病過(guò)程緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟的NK細(xì)胞具有不同的表型，在dnTGFβRⅡ(dominant-negative transforming growth factor-β receptor type Ⅱ)小鼠模型中，肝臟的DX5—NK細(xì)胞作為CD4+T細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可以通過(guò)抑制肝臟的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)來(lái)抑制肝臟炎癥，但是整體的NK細(xì)胞對(duì)于適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)是雙向的[6]。NKT細(xì)胞是打破免疫耐受的始動(dòng)者, 分泌多種細(xì)胞因子, 激活CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等多種細(xì)胞, 誘發(fā)PBC。

單核細(xì)胞也是PBC患者膽管周?chē)Ｒ?jiàn)的浸潤(rùn)細(xì)胞，促炎表型的單核細(xì)胞在PBC患者的外周血中顯著增多，在PBC中其促炎功能顯著升高，并且與肝臟的損傷程度有關(guān)[7]，此外，PBC患者外周血中的單核細(xì)胞對(duì)外界的刺激更加敏感，在病原相關(guān)分子模式刺激下，經(jīng)介導(dǎo)其分泌的促炎因子增多。

BEC是PBC中免疫破壞的靶細(xì)胞，在PBC的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。在相應(yīng)刺激下能分泌炎性因子以及趨化因子，可能和PBC的發(fā)病過(guò)程相關(guān)。此外，BEC表達(dá)HLA-I、HLA-II和多種共刺激分子，促進(jìn)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。有報(bào)道稱(chēng)，多種原因造成的BEC自噬通量下降，會(huì)使得肝內(nèi)中、小膽管反復(fù)受到免疫系統(tǒng)攻擊，不能通過(guò)自噬維持穩(wěn)態(tài)，最終導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化[8]，提示，維持細(xì)胞的自噬功能，增加其自噬通量，有可能成為治療PBC的新方向。

PBC主要由自身免疫驅(qū)動(dòng)，膽汁酸和腸道菌群同樣參與了疾病的進(jìn)展。膽汁酸能調(diào)節(jié)膽管反應(yīng)和膽汁淤積性損傷，并且膽汁酸會(huì)使得肝臟的炎癥持續(xù)，并且隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致纖維化。研究表明，對(duì)膽汁酸受體使用激動(dòng)劑、拮抗劑或補(bǔ)充特定的膽汁酸可以調(diào)節(jié)膽管細(xì)胞的增殖和功能[9]。腸道菌群和細(xì)菌移位被認(rèn)為是粘膜免疫反應(yīng)和耐受的重要原因，腸道微生物群的移位也被認(rèn)為可以促進(jìn)PBC[10]。

總之，PBC的發(fā)病受到多種因素的影響，其中，自身免疫耐受失衡和膽汁酸循環(huán)障礙是導(dǎo)致PBC發(fā)生的直接因素。膽汁酸循環(huán)障礙可能會(huì)導(dǎo)致膽汁淤積癥，而膽汁淤積將會(huì)對(duì)BEC產(chǎn)生毒性作用，損傷BEC；而自身免疫耐受失衡可能會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞持久性的攻擊BEC，導(dǎo)致BEC的進(jìn)一步損傷以及疾病的進(jìn)一步惡化。

2 PBC小鼠模型

在過(guò)去的幾十年中，一系列的PBC模型被相繼報(bào)道。這些模型加快了進(jìn)一步研究PBC的發(fā)病機(jī)制的速度，極大地促進(jìn)了PBC治療藥物的研發(fā)。本綜述介紹多種PBC小鼠模型，描述了該模型的形成原因、組織病理學(xué)變化及利用PBC小鼠模型對(duì)疾病發(fā)病機(jī)制和藥物開(kāi)發(fā)的研究進(jìn)展。

2.1 手術(shù)模型手術(shù)制備PBC小鼠模型的方法主要是膽管結(jié)扎模型(bile duct ligation, BDL)，通過(guò)結(jié)扎小鼠的膽總管，造成膽總管阻塞，膽汁淤積，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)，引發(fā)肝纖維化和肝硬化。該方法于實(shí)驗(yàn)小鼠腹腔切口，在十二指腸起始端膽總管處進(jìn)行膽總管結(jié)扎。此前的研究表明，對(duì)C57BL/6J雌性小鼠膽總管結(jié)扎，可導(dǎo)致小鼠肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，匯管區(qū)可見(jiàn)嗜中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[11]。此外，也有采用大鼠進(jìn)行膽管結(jié)扎并成功引起手術(shù)大鼠的膽管阻塞，膽汁淤積，總膽汁酸(total bile acid, TBA)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平升高的報(bào)道[12]。盡管該模型手術(shù)方法成熟、成模率高、實(shí)驗(yàn)成本低、可造成膽總管阻塞、肝內(nèi)膽汁淤積，但并未涉及引起PBC相關(guān)的特異性抗體AMA等因子升高，因此，該模型多用于膽汁淤積性疾病的研究。

2.2 藥物誘導(dǎo)模型

2.2.12-OA-BSA誘導(dǎo)模型 2-辛炔酸偶聯(lián)牛血清白蛋白(2-octynoic acid coupled to bovine serum albumin，2-OA-BSA)誘導(dǎo)的小鼠模型，可以很好地模擬人類(lèi)PBC的疾病特征。在完全弗氏佐劑的存在下，用包含結(jié)合分歧桿菌株H37Ra(10 g·L-1)的2-OA-BSA(100 g/25 L)腹膜內(nèi)接種8-9周齡的C57BL/6J雌性小鼠，隨后每隔2周在不完全弗氏佐劑的存在下，對(duì)小鼠進(jìn)行1次腹膜內(nèi)接種以加強(qiáng)誘導(dǎo)模型。

2-OA-BSA小鼠模型具有許多和人類(lèi)PBC類(lèi)似的血清學(xué)和病理學(xué)特征。用2-OA-BSA誘導(dǎo)小鼠，第4周時(shí)，小鼠血清中的抗丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(E2 subunits of pyruvate dehydrogenase，PDC-E2)IgG和IgM抗體顯著升高，第8周時(shí)血清抗PDC-E2的IgG和IgM、IgA抗體均升高。在2OA-BSA免疫4-12周時(shí)，血清腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNFα)以及干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)的水平升高，免疫12周后，小鼠的肝臟CD8+T淋巴細(xì)胞的比例增高，CD4+T淋巴細(xì)胞的比例降低，肝臟CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比例倒置，而脾臟中CD8+、CD4+T淋巴細(xì)胞比例均降低。匯管區(qū)可見(jiàn)大量的淋巴細(xì)胞或單核細(xì)胞浸潤(rùn)于受損的膽管周?chē)?，主要是CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，其中CD8+T淋巴細(xì)胞占主導(dǎo)地位。此外，還可以觀察到肝實(shí)質(zhì)和匯管區(qū)的脂肪減少，上皮樣肉芽腫的形成，肝實(shí)質(zhì)也可見(jiàn)小面積的輕度局灶性壞死，這些都與人類(lèi)的PBC相似。

該模型小鼠也有許多與不同于人類(lèi)PBC的血清學(xué)和病理學(xué)的特征，在2-OA-BSA誘導(dǎo)第24周時(shí)，未見(jiàn)肝臟的脂肪變性、嗜酸性粒細(xì)胞增多以及膽汁淤積的現(xiàn)象。此外，在該模型小鼠的其他組織器官，包括甲狀腺、唾液腺、肺、腎、小腸和結(jié)腸未產(chǎn)生免疫損傷，這與人類(lèi)PBC患者的肝外器官也出現(xiàn)炎癥反應(yīng)的特點(diǎn)不相符[13]。

采用2-OA-BSA誘發(fā)小鼠發(fā)生類(lèi)PBC疾病的方法，可能對(duì)人類(lèi)PBC的病因?qū)W提供了新的證據(jù)，即環(huán)境因素在人類(lèi)PBC發(fā)病中的重要性。

2.2.2DDC誘導(dǎo)模型 采用0.1%的1,4-二氫-2,4,6-三甲基-3,5-吡啶二甲酸二乙酯(3,5-diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine，DDC)對(duì)2月齡的雄性瑞士白化病小鼠飲食喂養(yǎng)8周，即可制備具有類(lèi)似人類(lèi)PBC特征的DDC小鼠模型。小鼠暴露于含有DDC的飲食中，可誘導(dǎo)卟啉積累、膽汁淤積、免疫反應(yīng)和類(lèi)似肝卟啉癥和硬化性膽管炎的肝膽損傷，出現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)PBC的膽管損傷和肝纖維化，但與人類(lèi)PBC不同的是該模型小鼠的膽管損傷與肝纖維化是平行發(fā)生的。此外，該模型小鼠出現(xiàn)一定的膽汁流量的減少，但是無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即未出現(xiàn)類(lèi)似人類(lèi)PBC的膽汁淤積癥狀。此外，DDC誘導(dǎo)了TNF-α以及骨橋蛋白的表達(dá)，骨橋蛋白的表達(dá)也偶見(jiàn)于人類(lèi)PBC[14]。

雖然，該模型小鼠表現(xiàn)出類(lèi)似人類(lèi)PBC的膽管和膽管周?chē)牟±頁(yè)p傷，但該模型小鼠中未觀察到AMA升高等人類(lèi)PBC的特異性血清學(xué)指標(biāo)，因此該模型小鼠一般用于觀察外源性因素誘導(dǎo)的膽道疾病和膽汁性肝纖維化。

2.2.3polyI:C誘導(dǎo)模型 肌苷酸聚胞苷酸(polyinosinic polycytidylic acid，poly I:C)，是一種1型干擾素(interferon, IFN)誘導(dǎo)劑，采用腹腔注射poly I:C(5 mg·kg-1)誘導(dǎo)6-8周齡雌性C57BL/6J小鼠，每周注射兩次，共28周，即可制備具有類(lèi)似人類(lèi)PBC特征的poly I:C小鼠模型[15]。

在poly I:C注射后小鼠血清IFN-α水平升高，注射后3 h內(nèi)達(dá)到最高，注射后24 h后逐漸下降至無(wú)法檢測(cè)，除了IFN-α外，poly I:C還誘導(dǎo)了其他的促炎細(xì)胞因子，包括IL-12 p70、IL-10、單核細(xì)胞趨化蛋白-1以及IFN-γ，其中，IL-6的水平在24 h后仍然較高。Poly I:C誘導(dǎo)4周后，小鼠出現(xiàn)唾液腺炎，胰腺炎以及間質(zhì)性腎炎。注射8周后，匯管區(qū)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要是CD4+以及CD8+T淋巴細(xì)胞，其中CD8+T淋巴細(xì)胞主要定位于膽管附近，肝臟組織中還檢測(cè)到CD11b+巨噬細(xì)胞以及CD11c+樹(shù)突細(xì)胞。此外，該模型小鼠血清ALT以及ALP的水平均升高，在polyI:C誘導(dǎo)第24周時(shí)，所有小鼠都表現(xiàn)出一種或兩種自身抗體。

Poly I:C誘導(dǎo)模型雖然在AMA的陽(yáng)性率以及肝纖維化等方面與人類(lèi)PBC特征有一定差異，但該模型在研究IFN-α在PBC的病因?qū)W中具有重要作用。

2.2.42-OA-BSA聯(lián)合polyI:C誘導(dǎo)模型 由于2-OA-BSA模型不具有人類(lèi)PBC患者的肝臟嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多以及肝纖維化等特點(diǎn)，而polyI:C模型存在AMA陽(yáng)性率過(guò)低等問(wèn)題，將2-OA-BSA與polyI:C聯(lián)合應(yīng)用于C57BL/6J小鼠，制得的聯(lián)合模型更好的模擬了人類(lèi)PBC。選用5-6周齡的雌性C57BL/6J小鼠，在2-OA-BSA首次注射免疫后的3 d注射polyI:C(5 mg·kg-1)，每3 d注射1次，即可制得2-OA-BSA聯(lián)合polyI:C小鼠模型。

該模型相較于自然病史和疾病嚴(yán)重程度較低的2-OA-BSA模型，表現(xiàn)出了更嚴(yán)重的膽管疾病，肝臟CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增加，IFN-γ、TNF-α、IL-12p40以及IL-6等多種炎性細(xì)胞因子的水平均增加。此外，該模型匯管區(qū)和肝實(shí)質(zhì)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多，肝臟纖維化形成的特點(diǎn)更加符合人類(lèi)PBC的病理特點(diǎn)。

2.3 抗原免疫模型

2.3.1新鞘氨醇桿菌免疫模型 新鞘氨醇桿菌(Novosphingobium aromaticivorans)是一種革蘭陰性菌，通常存在于土壤、水和海岸平原沉積物中,其和PBC患者體內(nèi)的線粒體自身抗原PDC-E2、側(cè)鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(2-Oxo acid dehydrogenase，BCOADC-E2)以及2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(2-Oxo-glutarate，OGDC-E2)具有高度的氨基酸同源性，并且與PBC患者體內(nèi)的PDC-E2表達(dá)相同的鞘糖脂CD1，可被NKT細(xì)胞識(shí)別并激活該細(xì)胞，將新鞘氨醇桿菌以5×107cfu靜脈注射C57BL/6J、NOD以及SLJ品系小鼠，兩周后所有品系小鼠均出現(xiàn)膽管損傷、匯管區(qū)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以及肉芽腫的形成等類(lèi)似人類(lèi)PBC的疾病表現(xiàn)。此外，該模型小鼠還表現(xiàn)出PDC-E2以及AMA的聚集、嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，80%的小鼠檢出AMA抗體陽(yáng)性[16]。

雖然該小鼠模型制備周期短，操作便捷，但所有的小鼠均未檢測(cè)到人類(lèi)PBC中所見(jiàn)的嚴(yán)重肝纖維化，并且在其他的組織器官，包括甲狀腺、腎臟、關(guān)節(jié)以及腸道中未發(fā)現(xiàn)慢性炎性，這也與人類(lèi)PBC的疾病表現(xiàn)不相符。

2.3.2大腸桿菌免疫模型 除了新鞘氨醇桿菌外，大腸桿菌肽序列中有6-8個(gè)氨基酸殘基與人類(lèi)PBC的PDC-E2具有同源性。將大腸桿菌以5×107cfu通過(guò)眶周靜脈叢注射入♀ 6周齡的NOD.B6Id10/Idd18小鼠體內(nèi)，14 d后采用同樣方法再次注射，即可制備大腸桿菌誘導(dǎo)模型。

大腸桿菌誘導(dǎo)模型相比于新鞘氨醇桿菌誘導(dǎo)模型，小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的膽道疾病，而且血清AMA滴度更高，大腸桿菌感染4周后，小鼠血清AMA滴度達(dá)到峰值，然后逐漸下降至與新鞘氨醇桿菌感染小鼠相同水平。大腸桿菌感染26周后，小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的匯管區(qū)炎癥反應(yīng)，并且伴有肉芽腫的形成，此外小鼠出現(xiàn)程度不一的膽管損傷，輕度表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞的聚集，重度膽管上皮細(xì)胞幾乎完全消失[17]。

雖然大腸桿菌誘導(dǎo)模型和新鞘氨醇桿菌誘導(dǎo)模型都未能使得小鼠表現(xiàn)出肝臟纖維化等人類(lèi)PBC特征，且該類(lèi)模型在制備時(shí)會(huì)造成小鼠合并發(fā)生尿路感染，降低模型制備的特異性，但是其為研究感染因素在PBC發(fā)病中的作用提供了新的思路。

2.3.3膽管蛋白免疫模型 BDP膽管蛋白(bile duct protein，BDP)模型，采用同系膽道抗原有效的破壞受體小鼠的免疫耐受。對(duì)野生型的8-12周齡C57BL/6J小鼠進(jìn)行BDP分離，然后對(duì)7-8周齡的小鼠進(jìn)行BDP免疫，即采用BDP乳液進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，即可制得BDP免疫小鼠模型。

研究表明，同基因的膽道抗原能有效地破壞受體小鼠的免疫耐受，并且在BDP免疫小鼠中表現(xiàn)出PBC的幾個(gè)關(guān)鍵特征，包括肝臟匯管區(qū)的特異性炎癥浸潤(rùn)，增加肝臟和脾臟的CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)目和激活狀態(tài)。小鼠的AMA呈100%陽(yáng)性，此外，在該模型中，肝臟和脾臟的Treg百分比都降低，這可能與T細(xì)胞的進(jìn)一步激活有關(guān)[18]。

BDP模型突破了以往PBC模型的局限，以往并沒(méi)有研究集中在突破耐受性的經(jīng)典模型，即用自體組織進(jìn)行免疫。因此，BDP模型強(qiáng)調(diào)膽管抗原在PBC發(fā)病機(jī)制中的作用。此外，BDP模型的建立主要依賴(lài)膽管抗原，而人體內(nèi)的膽管抗原可能反映分子擬態(tài)介導(dǎo)的環(huán)境因素，這與2-OA-BSA誘導(dǎo)的模型以及大腸桿菌誘導(dǎo)的模型相似。BDP模型強(qiáng)調(diào)的是通過(guò)激活自身免疫淋巴細(xì)胞耐受性崩潰的理論，這與基因突變所誘發(fā)的肝臟疾病不同。BDP模型也有著一些缺點(diǎn)和不足，在該模型中并沒(méi)有觀察到有肉芽腫的形成和膽管損傷，此外，該模型是否存在性別偏倚，仍有待進(jìn)一步研究。

2.3.4純化的AMA-M2免疫模型 AMA是PBC的特異性抗體，9個(gè)亞型中以AMA-M2的特異性最強(qiáng)。而AMA-M2主要針對(duì)線粒體內(nèi)膜上的PDC-E2抗原，這種抗原廣泛存在于體內(nèi)的有核細(xì)胞中，并且AMA僅作用于肝膽管線粒體抗原，但機(jī)制目前仍不清楚。

將純化的PDC-E2、OGDC-E2、BCOADC-E2三聯(lián)體抗原，無(wú)菌鹽水稀釋(1 g·L-1)后，乳化于等體積的完全弗氏佐劑，腹腔注射(200 μL/只)接種于C57BL/6J小鼠，即可制備AMA-M2誘導(dǎo)模型。免疫66周后，100%模型小鼠體內(nèi)出現(xiàn)AMA-M2抗體、血清ALP水平顯著升高，但模型小鼠肝臟并未出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)以及纖維化，雖然引起部分膽管損傷，但在其他組織器官中，如腎臟、胃和肌肉中也未觀察到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)[19]。

該模型制備周期長(zhǎng)，與人類(lèi)PBC相似的血清學(xué)和病理學(xué)特征有限，但該小鼠模型穩(wěn)定性高，可用于研究特異性抗體AMA-M2在PBC的作用。

2.4 基因自發(fā)模型

2.4.1NOD.c3c4小鼠模型 非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠可以自發(fā)自身免疫性Ⅰ型糖尿病，NOD.c3c4小鼠模型是第一個(gè)被報(bào)道的PBC自發(fā)小鼠模型，是在識(shí)別糖尿病的基因片段中偶然發(fā)現(xiàn)的。NOD.c3c4小鼠是在NOD小鼠的背景下，在其3號(hào)和4號(hào)染色體(c3/c4)上分別插入B6/B10來(lái)源的胰島素依賴(lài)性糖尿病(insulin dependent diabetes，Idd)的抗性等位基因。在B6和B10抗性等位基因與NOD基因組發(fā)生交互作用之后，導(dǎo)致了一種新型的可以遺傳控制的自身免疫性肝病，具有類(lèi)似人類(lèi)PBC的病理和生理特征。

NOD.c3c4小鼠模型表現(xiàn)出許多的肝臟組織病理學(xué)的異常，包括肝臟淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、匯管區(qū)炎癥反應(yīng)，以及受損膽管周?chē)人嵝粤＜?xì)胞浸潤(rùn)和上皮肉芽腫的形成。此外，50%-60%的小鼠在9-10周齡自發(fā)產(chǎn)生針對(duì)PDC-E2的自身抗體[20],80%-90%會(huì)產(chǎn)生抗核抗體，膽道上皮受累部位出現(xiàn)CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，有報(bào)道稱(chēng)對(duì)NOD.c3c4小鼠采用CD3單克隆抗體處理，可以使其免受自身免疫性肝病的侵害，但是在脾臟的過(guò)繼轉(zhuǎn)輸之后仍然會(huì)發(fā)生自身免疫性肝病[21]。這表明，T細(xì)胞在該疾病的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。

該模型與人類(lèi)PBC不同的一個(gè)方面是膽道上皮細(xì)胞的增生，在該模型中，膽管損傷和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)先于膽管上皮細(xì)胞的增殖[3]。該模型具有比人類(lèi)PBC更廣泛的膽管增生改變和自身免疫攻擊部位，NOD.c3c4小鼠以膽總管和肝內(nèi)膽管為靶標(biāo)，而PBC主要攻擊肝內(nèi)中小膽管。

盡管NOD.c3c4小鼠模型具有許多和人類(lèi)PBC相似的組織病理表型，但該模型仍存在AMA陽(yáng)性率較低，血清ALP無(wú)法測(cè)得等缺點(diǎn)，此外該模型小鼠發(fā)病不存在性別偏倚。

2.4.2dnTGFβRⅡ小鼠模型 在NOD.c3c4小鼠模型造模成功后，研究者發(fā)現(xiàn)TGFβⅡ型受體顯性抑制(dominant-negative transforming growth factor-βreceptor type Ⅱ，dnTGFβRⅡ)轉(zhuǎn)基因小鼠模型可自發(fā)產(chǎn)生和人類(lèi)PBC相似的組織病理學(xué)表現(xiàn)[22]。TGFβⅡ型受體是TGFβ在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中至關(guān)重要的受體，它能夠調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活化。dnTGFβRⅡ小鼠在CD4啟動(dòng)子的作用下過(guò)度表達(dá)TGFβ受體Ⅱ型顯性抑制基因，最終導(dǎo)致小鼠部分T細(xì)胞中的TGFβ信號(hào)缺失。而T細(xì)胞中的TGFβ信號(hào)維持了周?chē)鶷reg細(xì)胞，并以細(xì)胞自主的方式抑制T細(xì)胞的增殖、激活和分化，缺乏這種信號(hào)將會(huì)導(dǎo)致小鼠嚴(yán)重的自身免疫和早期死亡。

該模型小鼠針對(duì)人類(lèi)PBC中的主要自身抗原PDC-E2、OGDC-E2以及BCOADC-E2自發(fā)產(chǎn)生AMA，并且呈100%陽(yáng)性。dnTGFβRⅡ小鼠的肝臟組織學(xué)表明100%的小鼠在肝實(shí)質(zhì)和門(mén)靜脈區(qū)有類(lèi)似于人類(lèi)PBC的CD4+、CD8+以及CD19+T淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)。并且25%-50%的22周齡的小鼠，會(huì)產(chǎn)生膽管損傷，這一點(diǎn)也可見(jiàn)于人類(lèi)的PBC[23]。此外，與人類(lèi)PBC患者相似，dnTGFβRⅡ小鼠的肝臟中CD8+/CD4+T細(xì)胞的水平升高，血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-12 p40水平均顯著增加[22]。dnTGFβRⅡ小鼠表現(xiàn)出和人類(lèi)PBC相似的主要血清學(xué)和組織學(xué)特征，這表明TGFβ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在PBC的發(fā)病中可能起著至關(guān)重要的作用。

dnTGFβRⅡ小鼠也具有許多與人類(lèi)PBC的不同之處，該模型小鼠不存在類(lèi)似于人類(lèi)PBC的性別偏倚，肝內(nèi)無(wú)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肉芽腫形成也不明顯。

此前有報(bào)道，將dnTGFβRⅡ小鼠脾臟的CD4+以及CD8+T細(xì)胞過(guò)繼轉(zhuǎn)移到Rag1-/-小鼠體內(nèi)，結(jié)果Rag1-/-小鼠出現(xiàn)了類(lèi)似人類(lèi)的PBC疾病表現(xiàn)，表明脾臟的T細(xì)胞以及B細(xì)胞的耐受性的喪失導(dǎo)致了PBC。為了進(jìn)一步研究T細(xì)胞在PBC發(fā)病中的作用，分別將CD4+以及CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag1-/-小鼠體內(nèi)，結(jié)果CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的Rag1-/-小鼠出現(xiàn)了結(jié)腸炎，而CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的Rag1-/-小鼠出現(xiàn)了類(lèi)似于人類(lèi)PBC的疾病表現(xiàn)，這表明，CD8+T細(xì)胞在膽管損傷中起著至關(guān)重要的作用[23]。將dnTGFβRⅡ小鼠與B細(xì)胞缺陷小鼠(Igμ-/-小鼠)進(jìn)行雜交，用以評(píng)估B細(xì)胞在肝臟的炎癥浸潤(rùn)以及伴隨的結(jié)腸炎中的作用。結(jié)果表明，Igμ-/-dnTGFβRⅡ小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的膽管損傷以及結(jié)腸炎，提示B細(xì)胞在dnTGFβRⅡ小鼠中具有抑制炎性浸潤(rùn)的作用[24]。為了進(jìn)一步確認(rèn)B細(xì)胞在dnTGFβRⅡ小鼠組織病理中的作用，對(duì)幼齡小鼠(4-6周)以及成年小鼠(20-22周)分別進(jìn)行B細(xì)胞耗竭治療。結(jié)果表明，幼齡小鼠在經(jīng)過(guò)治療后，其肝臟的炎癥浸潤(rùn)情況以及血清AMA水平明顯降低，但是結(jié)腸炎有加重傾向，同樣對(duì)于已經(jīng)發(fā)病的成年小鼠進(jìn)行治療則無(wú)效，提示，B細(xì)胞在PBC的發(fā)病過(guò)程中起著雙向的作用[25]。除了在T、B細(xì)胞的研究上提供了新的思路外，dnTGFβRⅡ小鼠也被應(yīng)用于CD-1d限制NKT細(xì)胞、IFN-γ和IL-12在PBC病理過(guò)程中的作用的研究，為PBC的病理學(xué)和免疫學(xué)研究中提供了新的思路和方法。

2.4.3IL-2R-/-小鼠模型 白細(xì)胞介素-2(interleukin-2，IL-2)對(duì)于CD4+、CD25+Treg細(xì)胞亞群的發(fā)育和外周擴(kuò)張起著至關(guān)重要的作用，而CD4+、CD25+Treg細(xì)胞可以通過(guò)抑制T細(xì)胞的體內(nèi)反應(yīng)提高機(jī)體的自我耐受性。

將C57BL/6J背景來(lái)源的小鼠敲除IL-2R基因后，IL-2R-/-小鼠產(chǎn)生與慢性非化膿性破壞性膽管炎相似的血清學(xué)和病理學(xué)特征，這也可見(jiàn)于人類(lèi)PBC。IL-2R-/-小鼠血清學(xué)檢測(cè)呈現(xiàn)出100%的AMA的陽(yáng)性，此外，IL-2R-/-小鼠的匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增多，并且CD8+/CD4+T細(xì)胞的比例也有所升高。與dnTGFβRⅡ小鼠的過(guò)繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)所表明的結(jié)果相同，敲除CD4+T細(xì)胞的IL-2R-/-實(shí)驗(yàn)小鼠表現(xiàn)出結(jié)腸炎的發(fā)生以及嚴(yán)重程度的降低，而敲除CD8+T細(xì)胞的IL-2R-/-結(jié)腸炎的小鼠則表現(xiàn)出缺乏膽管損傷的病理學(xué)表現(xiàn)，同樣提示CD8+T細(xì)胞是PBC發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞[26]。

值得注意的是，IL-2R-/-小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的自身免疫性膽管炎的同時(shí)，也伴隨發(fā)生全身的腸道疾病，25%-50%的小鼠在8-20周齡的時(shí)候死于嚴(yán)重的溶血性貧血。

AE2a,b-/-小鼠表現(xiàn)出和人類(lèi)PBC相似的疾病表現(xiàn)，血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)除AMA升高外，IgG、IgM以及ALP的水平均升高。此外，該模型小鼠還表現(xiàn)出脾腫大，IL-12 p70和IFN-γ的水平升高，CD4+Foxp3+Treg表達(dá)減少。約1/3的小鼠會(huì)發(fā)生膽管損傷，損傷膽管周?chē)约皡R管區(qū)可見(jiàn)CD4+、CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)[27]。

雖然AE2a,b-/-小鼠在研究PBC的發(fā)病機(jī)制方面起到了一定的作用，但是該模型仍存在發(fā)病遲緩、不存在性別偏倚、難以繁衍以及AMA陽(yáng)性率低等問(wèn)題，為其應(yīng)用帶來(lái)了一定的限制。

2.4.5ARE-Del-/-小鼠模型 ARE-Del-/-小鼠模型和人類(lèi)PBC具有高度相似的疾病表現(xiàn)，該模型是通過(guò)敲除IFN型基因3'非翻譯區(qū)中具有162 nt的腺嘌呤尿嘧啶富含元件(adenylate uridylate-rich element，ARE)而形成的[28]。

ARE-Del-/-小鼠存在著類(lèi)似人類(lèi)PBC發(fā)病的女性偏倚現(xiàn)象，20周齡的雌性小鼠的肝臟可觀察到中度到重度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，而同樣條件下的雄性小鼠只有輕度到中度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，雌性ARE-Del-/-小鼠的匯管區(qū)和肝小葉炎癥、小膽管的破壞較嚴(yán)重，也可觀察到明顯的肉芽腫的形成，雌性小鼠還可見(jiàn)輕度的肝纖維化，而雄性小鼠則無(wú)法觀測(cè)到。在血清學(xué)特征上，8-10周齡的雌性小鼠可觀察到抗PDC-E2、OGDC-E2以及BCOADC-E2等自身抗體，其中主要是抗PDC-E2自身抗體。而在20周齡時(shí)，雌性小鼠AST、ALT以及總膽汁酸水平較雄性小鼠均明顯升高。

報(bào)道稱(chēng)，將ARE-Del-/-小鼠CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至B6/Rag1-/-小鼠體內(nèi)，引起受體小鼠發(fā)生匯管區(qū)以及肝實(shí)質(zhì)的炎癥浸潤(rùn)，并且膽管損傷和肉芽腫的形成降到最低，此外，在CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，受體小鼠血清IFN-γ、TNF-α以及IL-6的水平均顯著升高，而采用相同方法將ARE-Del-/-小鼠的CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移至B6/Rag1-/-小鼠后，受體小鼠僅發(fā)生輕度的匯管區(qū)和肝實(shí)質(zhì)炎性浸潤(rùn)，無(wú)肉芽腫形成，IFN-γ、TNF-α以及IL-6等血清學(xué)指標(biāo)也無(wú)顯著變化，提示CD4+T細(xì)胞在ARE-Del-/-小鼠的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵的作用。性別偏倚是ARE-Del-/-小鼠模型的優(yōu)勢(shì)之一，在雌性小鼠中，差異表達(dá)的基因具有更強(qiáng)的Ⅰ型和Ⅱ型干擾素信號(hào)和淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，可能是導(dǎo)致該模型小鼠產(chǎn)生類(lèi)似人類(lèi)PBC的女性偏倚的原因?？傊?，改變IFN-γ表達(dá)在PBC的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[29]。

3 總結(jié)

PBC是一種以AMA的存在和肝內(nèi)膽管進(jìn)行性破壞為特征的肝臟特異性自身免疫性疾病，其發(fā)病過(guò)程可能涉及環(huán)境、遺傳易感性、免疫耐受異常等多種因素。由于PBC的發(fā)病涉及多種因素，其臨床過(guò)程可能較為復(fù)雜，因此，利用動(dòng)物模型對(duì)闡明PBC的發(fā)病機(jī)制具有一定的價(jià)值。

Tab 1 Comparison between human PBC and murine models of PBC

本文綜述了手術(shù)模型、藥物誘導(dǎo)模型、抗原免疫模型以及基因自發(fā)小鼠模型，雖然目前針對(duì)PBC的動(dòng)物模型種類(lèi)繁多，但也正因PBC的發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，現(xiàn)有動(dòng)物模型還不能夠完全模擬人類(lèi)PBC的疾病表現(xiàn)，每一種動(dòng)物模型在模擬人類(lèi)疾病上都有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和不足。手術(shù)模型制備簡(jiǎn)單、成本低廉，在研究膽汁淤積方面方法成熟、成模率高；藥物誘導(dǎo)模型通過(guò)藥物來(lái)誘導(dǎo)小鼠自身免疫耐受失調(diào)，最終導(dǎo)致發(fā)生類(lèi)似人類(lèi)PBC的疾病表現(xiàn)，該類(lèi)模型的制備驗(yàn)證了環(huán)境因素在PBC發(fā)病中的關(guān)鍵作用；而抗原免疫模型利用自身抗原或和自身抗原具有氨基酸同源性的異種抗原免疫小鼠，強(qiáng)調(diào)了在PBC發(fā)病過(guò)程中，自身抗原以及感染因素的作用；基因自發(fā)模型均可自發(fā)產(chǎn)生類(lèi)似人類(lèi)PBC的疾病特征，在研究天然免疫和適應(yīng)性免疫在PBC發(fā)病過(guò)程中的作用有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但該類(lèi)小鼠成本較高，并且大多數(shù)的基因自發(fā)小鼠存在著難以繁衍等問(wèn)題。事實(shí)上，每一種動(dòng)物模型都各有優(yōu)劣，由于PBC發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，任何單一的動(dòng)物模型都很難完全模擬其疾病表現(xiàn)，但也正是這些各有優(yōu)劣的動(dòng)物模型的共同使用研究，讓我們對(duì)PBC有了更進(jìn)一步的了解。而正因?yàn)槲覀兡壳皩?duì)PBC的了解，將會(huì)促進(jìn)我們?cè)谖磥?lái)開(kāi)發(fā)更加合適匹配的動(dòng)物模型，也將促進(jìn)對(duì)PBC發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步探索和治療藥物研發(fā)。