謝雨欣，許峰晟，王 彤，楊春宇，周雪冰，任香善

(延邊大學(xué) 1. 醫(yī)學(xué)院、2. 腫瘤研究中心、3. 國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002)

類器官是由干細(xì)胞驅(qū)動(dòng)而以自我組裝的方式構(gòu)建形成的3D細(xì)胞復(fù)合體，能夠模擬人體器官的結(jié)構(gòu)和功能[1]。類器官的3D培養(yǎng)是指將分離出的干細(xì)胞植入含多種生長(zhǎng)因子的基質(zhì)膠中，在一定體外條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成的包含不同組織來源的上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)、能夠不斷自我增殖及分化、與目的器官功能相類似的3D細(xì)胞復(fù)合體。類器官根據(jù)來源可分為3種：胚胎干細(xì)胞和多能干細(xì)胞等衍生的類器官、組織來源干細(xì)胞衍生的類器官以及腫瘤患者來源的病變干細(xì)胞衍生的類器官。

自2014年Lancaster和Knoblich首次系統(tǒng)地提出類器官的概念[2]以來，類器官技術(shù)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步。研究者們根據(jù)不同組織來源的類器官制定最適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)體系，并將其在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)，保存了其來源患者的組織學(xué)特征及基因組特性。目前，類器官模型主要應(yīng)用于腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究、分子標(biāo)志物的篩選及各類藥物的毒性檢測(cè)、藥效評(píng)價(jià)、新藥篩選、建立臨床前模型、精準(zhǔn)醫(yī)療、研究組織器官發(fā)育及組織器官的移植和修復(fù)等領(lǐng)域(Fig 1)。該文將對(duì)類器官模型在腫瘤治療中的研究現(xiàn)狀、應(yīng)用及前景進(jìn)行綜述。

1 類器官技術(shù)在腫瘤中的研究現(xiàn)狀

從2009年Sato等[3]成功進(jìn)行腸類器官的長(zhǎng)期培養(yǎng)后，類器官的研究開始逐漸發(fā)展，但由于缺乏有效的培養(yǎng)體系，其臨床應(yīng)用受到了極大限制。類器官培養(yǎng)基的成分可分為一般成分和特殊成分。目前，類器官培養(yǎng)基的一般成分[4]主要包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分、B27(一種可以代替血清的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑)、氨基酸類、抗壞血酸等。不同類器官所需特殊成分不盡相同，如Wnt-3A常被加入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的培養(yǎng)基中，R-spondin-1(一種可增強(qiáng)β-catenin依賴型Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞外蛋白)在乳腺、小腸、肝臟類器官的發(fā)育生長(zhǎng)過程中起支持作用，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)則可在腸類器官中發(fā)揮重要作用。由于腫瘤組織中存在被異常激活的促增殖信號(hào)通路或與該通路相關(guān)的生長(zhǎng)因子，這些信號(hào)通路或生長(zhǎng)因子并非培養(yǎng)基的必要成分，它們的存在反而影響腫瘤的生長(zhǎng)分化。因此，針對(duì)這種特殊腫瘤類器官制定選擇性培養(yǎng)基至關(guān)重要[5]。如某些結(jié)直腸癌中，Wnt信號(hào)通路常被特異激活，在該類培養(yǎng)基中可去除Wnt和R-spondin-1；同樣，對(duì)于存在EGF受體通路突變的結(jié)直腸癌，可去除EGF。通過建立不同類型的培養(yǎng)基，能夠構(gòu)建出相應(yīng)突變類型的癌癥類器官。通過這種方法培養(yǎng)出來的類器官既保留了原腫瘤的組織病理學(xué)特征以及基因組穩(wěn)定性[6]，可用于腫瘤的基礎(chǔ)研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。相比于腸癌類器官，胃癌類器官的研究起步較晚但進(jìn)展迅速。美國(guó)學(xué)者利用胃類器官闡明了幽門螺桿菌感染誘發(fā)胃癌的機(jī)制；日本學(xué)者在短時(shí)間內(nèi)建立了67例胃癌生物庫并深度探索了胃癌的形態(tài)學(xué)、基因組學(xué)、功能學(xué)及胃癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制；Yan等[7]建立了來自34位患者的原發(fā)性胃癌類器官生物庫，經(jīng)長(zhǎng)期培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其基因組圖譜仍與體內(nèi)腫瘤極為相似。而由于肝細(xì)胞的多樣性和功能的復(fù)雜性，肝臟腫瘤類器官的研究仍不夠充分。2017年，Broutier等[8]將3種不同亞型的原發(fā)性肝癌，包括肝細(xì)胞癌、膽管癌、混合型肝癌進(jìn)行類器官培養(yǎng)，去除了R-spondin-1，Noggin和Wnt3a，但補(bǔ)充了地塞米松和Rho激酶抑制劑，成功證明了肝癌類器官能夠保留原始腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及基因組構(gòu)成。2015年Boj等[9]建立了胰腺腫瘤類器官，發(fā)現(xiàn)一些正常的胰腺組織樣本在準(zhǔn)備胰島移植時(shí)被預(yù)先消化，將消化后的材料植入基質(zhì)凝膠中優(yōu)化培養(yǎng)條件，以支持人類正常和惡性胰腺組織的繁殖。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者通過優(yōu)化培養(yǎng)基方案，構(gòu)建了正常胰腺組織以及5種胰腺癌亞型(導(dǎo)管腺癌、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、腺泡細(xì)胞癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤)的胰腺類器官庫[10]，并證明類器官模型可用于進(jìn)一步探索新輔助治療失敗患者的治療方案。

Fig 1 Establishment and application of organoid model

乳腺癌的研究目前基于2D細(xì)胞模型和動(dòng)物模型，但物種差異與組織差異限制了乳腺癌的研究。Sachs等[11]已開發(fā)出優(yōu)化的乳腺癌類器官培養(yǎng)條件，在體外培養(yǎng)條件中新增加neuregulin 1蛋白，解決了人源腫瘤異種移植模型培養(yǎng)效果差及無法在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的問題。同樣地，Djomehri等[12]也針對(duì)培養(yǎng)基提出了優(yōu)化條件，他們假設(shè)支架材料本身可能通過機(jī)械約束和/或限制關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素的供應(yīng)來限制類器官的生長(zhǎng)，因此他們建立了無支架的3D乳腺類器官模型以供研究。實(shí)驗(yàn)證明，無支架的3D乳腺類器官模型具有高度一致性和可重復(fù)性的優(yōu)勢(shì)，能夠依靠生物打印標(biāo)準(zhǔn)化3D培養(yǎng)物的分析，不僅可用于研究腫瘤微環(huán)境對(duì)乳腺癌發(fā)生的影響，還可用于使用患者衍生的腫瘤標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)中，以促進(jìn)大規(guī)模藥物篩選和患者類器官生物庫的研究。同樣，卵巢癌也是女性的惡性腫瘤之一。最近，兩個(gè)獨(dú)立的科研團(tuán)隊(duì)報(bào)告成功建立了卵巢癌類器官模型。這些癌癥類器官能顯示出原有病變組織的體細(xì)胞突變和擴(kuò)增/缺失[13]以及親本腫瘤的標(biāo)志物表達(dá)、突變情況等組織學(xué)和基因組特征[14]。例如，他們?cè)谀[瘤抑制基因CREBBP、FOXO1、PRKAR1A和CHEK2中發(fā)現(xiàn)了移碼和非同義突變；在腫瘤和相應(yīng)的類器官中檢測(cè)到卵巢癌相關(guān)基因BRAF和NOTCH1的非移碼插入和缺失；粘蛋白16也被發(fā)現(xiàn)在類器官中表達(dá)，它編碼的癌抗原在正常卵巢表面上皮中無法檢測(cè)到，但能在卵巢癌上皮中表達(dá)，因此可在晚期卵巢癌隨訪中用作生物標(biāo)志物。此外，類器官因其與原有組織的高度一致性對(duì)化療顯示出腫瘤特異性和敏感性，為卵巢癌藥物篩選和治療提供可靠臨床前工具和研究平臺(tái)。

除了上述消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)來源的類器官之外，其他系統(tǒng)來源的類器官研究也在逐步開展。目前肺癌類器官體外培養(yǎng)的干細(xì)胞主要來源于肺癌患者，研究者通過3D培養(yǎng)建立了能夠更廣泛地用于臨床前研究的5種肺癌亞型[15]，包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺鱗癌、大細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌的類器官模型[16]。這些模型的建立可預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的反應(yīng)及肺癌個(gè)性化藥物的開發(fā)。研究者建立的前列腺癌類器官模型在體外傳代后，與腫瘤具有相同的體細(xì)胞突變以及相似的轉(zhuǎn)錄組。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[17]，突變的FOXA1能夠抑制雄激素信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，這一新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為將來的研究確定了優(yōu)先方向。Mullenders等[18]調(diào)整出不同培養(yǎng)基條件，建立了膀胱癌基底細(xì)胞類器官。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3突變的細(xì)胞在不添加任何生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中可長(zhǎng)時(shí)間增殖；同時(shí)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7/10可促進(jìn)膀胱癌類器官生長(zhǎng)。他們成功培養(yǎng)了超過30個(gè)傳代的多個(gè)類器官系，為膀胱癌類器官生物庫的建立及治療膀胱癌的藥物篩查提供了可能性。

2 類器官模型在腫瘤研究中的應(yīng)用

2.1 類器官模型在病理研究中的應(yīng)用類器官模型可用于特定腫瘤表達(dá)的分子標(biāo)志物篩選、癌癥病人分級(jí)分期、預(yù)后的推測(cè)以及治療方案的制定。Gendoo等[19]建立了患者來源的胰腺導(dǎo)管腺癌異種移植模型和類器官模型，并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序，證實(shí)了類器官模型可用于分子標(biāo)志物篩查及患者預(yù)后的判定。Saito等[20]也建立了人肝內(nèi)膽管癌、膽囊癌和Vater壺腹神經(jīng)內(nèi)分泌癌類器官，確定SOX2、KLK6和CPB2可作為膽管癌患者的預(yù)后生物標(biāo)志物。針對(duì)不同腫瘤所表達(dá)的不同分子標(biāo)志物，分離患者腫瘤細(xì)胞進(jìn)行類器官培養(yǎng)，能夠判斷癌癥病人分級(jí)分期且篩選出最適合的治療藥物。同時(shí)，類器官模型具有實(shí)時(shí)觀測(cè)并修改治療方案的優(yōu)勢(shì)，針對(duì)長(zhǎng)期使用某種藥物而產(chǎn)生耐藥性的情況也能實(shí)時(shí)進(jìn)行藥物優(yōu)化。

2.2 藥物篩選、新藥開發(fā)和精準(zhǔn)治療傳統(tǒng)的腫瘤藥物篩選主要依賴于2D細(xì)胞系培養(yǎng)和人源腫瘤異種移植(patient derived tumor xenograft，PDTX)。2D的細(xì)胞系培養(yǎng)操作簡(jiǎn)便，但來源較為單一，與原有腫瘤表達(dá)譜的差異顯著且無法長(zhǎng)期培養(yǎng)。PDTX來源多樣化，與原有腫瘤表達(dá)譜的差異小且能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)，但由于建模周期長(zhǎng)、費(fèi)用高、難度大等問題限制了其臨床應(yīng)用。因此，在亟需更加精確的腫瘤藥物篩選的情況下，類器官技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一難題。

“精準(zhǔn)治療”是類器官模型的一大優(yōu)勢(shì)。腫瘤類器官在很大程度上保持了原有腫瘤的異質(zhì)性和生物學(xué)特性，因此能夠通過體外研究來制定個(gè)性化治療方案。Wetering等[21]已經(jīng)證明了大腸癌生物庫的重要性，該庫能夠根據(jù)患者自身的特異性進(jìn)行藥物篩選，通過患者自身來源的腫瘤類器官培養(yǎng)物，測(cè)試各種藥物的敏感性和毒性從而獲得最適合患者的治療方法。Broutie等[8]成功證明肝癌類器官能夠保留原始腫瘤的組織學(xué)結(jié)構(gòu)及基因組構(gòu)成，并通過類器官技術(shù)證明了C19ORF48、UBE2S、DTYMK、C1QBP和STMN1是與原發(fā)性肝癌預(yù)后不良相關(guān)的新基因，但仍需要進(jìn)一步研究證明其作為預(yù)后指標(biāo)的實(shí)用性。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步增進(jìn)了對(duì)肝癌生物學(xué)的了解，并為開發(fā)針對(duì)該疾病的個(gè)性化治療方法提供依據(jù)。根據(jù)遺傳變化(如EGF受體突變)以及生物標(biāo)志物(如程序性死亡配體1)的表達(dá)，Kim等[15]開發(fā)出了肺癌的標(biāo)準(zhǔn)化分子靶向療法。研究發(fā)現(xiàn)的潛在靶點(diǎn)、生物標(biāo)志物或遺傳變化等都有望幫助科研人員開發(fā)出新型藥物。已有科研人員通過體外類器官實(shí)驗(yàn)提出新型聯(lián)合治療方案，將類器官技術(shù)與靶向治療相結(jié)合，類器官充當(dāng)活體生物標(biāo)志物以預(yù)測(cè)每個(gè)患者的治療反應(yīng)和耐藥性，從而指導(dǎo)“精準(zhǔn)治療”。

2.3 腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究類器官的體外培養(yǎng)能夠模擬癌癥的發(fā)生過程，因此可用于對(duì)癌癥發(fā)生機(jī)制的研究。李亮等[22]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的腸癌類器官多數(shù)存在Uhrf2缺失，在含有Uhrf2的腸癌類器官中將Uhrf2敲除，腫瘤干細(xì)胞數(shù)明顯減少，且腫瘤小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)。其分子機(jī)制為Uhrf2與Wnt信號(hào)通路下游的重要轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子4結(jié)合，通過抑制T細(xì)胞因子4的泛素化降解，最終激活Wnt信號(hào)通路下游基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此Uhrf2可視為腫瘤干細(xì)胞治療腸腫瘤的一個(gè)靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者[23]成功建立了腹水來源的胃癌類器官，發(fā)現(xiàn)胃癌腹水上清可以激活惡性腹水來源的腫瘤類器官和胃癌細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，且腹水上清促惡性腹水來源的腫瘤類器官生長(zhǎng)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活呈正相關(guān)。當(dāng)Wnt信號(hào)存在時(shí)，Dishevelled蛋白抑制Axin/APC/GSK-3β復(fù)合物使之不能磷酸化降解β-catenin，非磷酸化的β-catenin轉(zhuǎn)運(yùn)入核調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。同時(shí)根據(jù)STAT3的激活可以增加β-catenin在細(xì)胞核中的定位，他們推斷STAT3信號(hào)通路可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路在促腫瘤細(xì)胞生存和轉(zhuǎn)移過程中起協(xié)同作用。通過對(duì)膽囊癌類器官的測(cè)序結(jié)果分析，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[24]，膽囊癌中高表達(dá)的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體通過抑制MAPK/ERK通路的ERK的磷酸化激活，減少基質(zhì)金屬蛋白酶1和10的表達(dá)，而基質(zhì)金屬蛋白酶1和10可以促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，因此睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體可導(dǎo)致膽囊癌轉(zhuǎn)移受抑制。胰腺腫瘤細(xì)胞與胰腺腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的相互作用可以引起腫瘤細(xì)胞代謝信號(hào)通路的失調(diào)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[25]。針對(duì)胰腺癌類器官的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示[26]，GATA6表達(dá)程度與Wnt7B表達(dá)程度呈負(fù)相關(guān)，GATA6可通過影響Wnt7B及其下游信號(hào)分子決定胰腺癌類器官對(duì)Wnt/R-spondin信號(hào)通路的依賴性。

3 類器官模型的優(yōu)勢(shì)與不足

類器官模型的優(yōu)勢(shì)主要在于其前瞻性、精準(zhǔn)性以及高效性。首先，使用類器官作為臨床前癌癥模型已經(jīng)成為可能，研究者可以通過類器官技術(shù)建立腸癌等類器官模型，指導(dǎo)相應(yīng)癌癥發(fā)生機(jī)制及治療方法的研究。其次，類器官模型能夠指導(dǎo)癌癥的精準(zhǔn)治療并推動(dòng)下一代研究。腫瘤的精準(zhǔn)治療依賴于對(duì)藥物敏感性的檢測(cè)，由于基因突變的普遍性及隨機(jī)性，患者對(duì)藥物的敏感性因人而異，傳統(tǒng)的藥物篩選系統(tǒng)篩選出的藥物臨床應(yīng)用價(jià)值低且價(jià)格昂貴。最后，一種藥物的研發(fā)周期一般在12年左右，而類器官模型的應(yīng)用可以大大節(jié)省時(shí)間和精力。相比2D細(xì)胞培養(yǎng)和PDTX，類器官取材靈活，且能夠極大地節(jié)省建模時(shí)間，例如，使用PDTX建立小鼠模型需要6-8個(gè)月，而類器官模型只需1個(gè)月左右。

類器官技術(shù)是一項(xiàng)近幾年才發(fā)展起來的新興技術(shù)，相比于2D細(xì)胞培養(yǎng)模型和PDTX模型具有一定優(yōu)勢(shì)，但仍然存在不少問題，主要包括共培養(yǎng)問題、復(fù)雜性問題、微環(huán)境成分問題以及培養(yǎng)方法問題。第一，腫瘤微環(huán)境細(xì)胞可與癌細(xì)胞共培養(yǎng)但時(shí)間有限[27]，如何進(jìn)行腫瘤微環(huán)境與癌細(xì)胞的長(zhǎng)期共培養(yǎng)成為亟需解決的問題；第二，目前類器官技術(shù)難以完全重現(xiàn)機(jī)體內(nèi)部復(fù)雜的生理調(diào)控過程[27]，如何培養(yǎng)出具有神經(jīng)系統(tǒng)的形體更大、結(jié)構(gòu)功能更復(fù)雜的類器官也是亟待解決的問題；第三，腫瘤微環(huán)境的建立依舊不夠完善，由于腫瘤微環(huán)境會(huì)影響腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，類器官模型中缺乏微環(huán)境成分可能會(huì)導(dǎo)致正常上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化失敗，因此各類腫瘤類器官體外培養(yǎng)的微環(huán)境成分需要一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)；第四，在類器官培養(yǎng)過程中，還可能因?qū)嶒?yàn)室培養(yǎng)方法不同(例如生長(zhǎng)因子的差異)造成類器官的差異，因此還缺少一個(gè)確定的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法。

4 總結(jié)與展望

類器官模型是當(dāng)今社會(huì)干細(xì)胞領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破。對(duì)研究者而言，依靠類器官模型可以在體外研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，不斷發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證新的腫瘤靶點(diǎn)，從而為新藥開發(fā)提供依據(jù)，甚至有望在未來通過類器官技術(shù)進(jìn)行藥物優(yōu)化，解決機(jī)體的耐藥性問題。類器官模型有助于癌癥發(fā)病的建模以及腫瘤分子表型的確認(rèn)，以便發(fā)現(xiàn)各種器官以及腫瘤譜系的起源腫瘤細(xì)胞的生物標(biāo)志物[28]。對(duì)患者而言，癌癥綜合治療模式將成為大勢(shì)所趨，每一位患者都將通過自身來源的腫瘤類器官的體外實(shí)驗(yàn)，獲得個(gè)體化治療方案。離體生長(zhǎng)的人源組織還可以取代器官捐贈(zèng)的需求，為亟需器官移植的患者提供便利[29]。隨著類器官技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，不僅能夠建立罕見疾病的體內(nèi)外模型、實(shí)現(xiàn)高通量藥物篩選，還能夠?qū)崟r(shí)觀測(cè)人類早期的發(fā)展過程[29]，甚至可以與實(shí)時(shí)成像技術(shù)、3D打印技術(shù)結(jié)合，探索出一種治療癌癥的新方法。