楊麗玲，周湘君，晏麗君，余林中

(1.暨南大學(xué)附屬東莞醫(yī)院臨床藥學(xué)科，廣東 東莞 523900； 2.廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 523808； 3.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣東 廣州 510515)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是以肺實質(zhì)細(xì)胞損傷為主要特征的急性低氧血癥，其嚴(yán)重階段為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)，嚴(yán)重感染及細(xì)胞因子風(fēng)暴引起失控的全身性炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)生的重要原因，急性胰腺炎、膿毒癥、新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)、甲型流感(H1N1、H5N1及H7N9)等重癥及危重病例均會出現(xiàn)ALI。目前，對于ALI尚缺乏滿意的治療藥物，糖皮質(zhì)激素的應(yīng)用受到廣泛質(zhì)疑，盡管應(yīng)用了機(jī)械通氣、體外膜氧合等綜合治療措施，病死率仍高達(dá)40%，成為危重病醫(yī)學(xué)的難點[1-2]。中醫(yī)學(xué)對ALI的認(rèn)識頗有特色，中西醫(yī)結(jié)合的防治措施對ALI的治療作用也得到了肯定[3-4]。尤其對于COVID-19疫情的防控，中醫(yī)藥全程介入、中西醫(yī)結(jié)合治療在控制疾病進(jìn)程、提高治愈率等方面優(yōu)勢明顯[5]。涼膈散為中醫(yī)溫病治療經(jīng)典名方，由黃芩、連翹、山梔子、薄荷、大黃、芒硝、淡竹葉和甘草組成。相關(guān)的臨床研究[6]及本團(tuán)隊先期的實驗研究[7]結(jié)果均表明，涼膈散是治療嚴(yán)重感染及炎癥所致ALI的有效方，但該方的主要作用靶點和作用機(jī)制尚未明確，有必要進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子過度釋放可誘發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致ALI，細(xì)胞因子風(fēng)暴是推動ALI向ARDS進(jìn)展的主要原因[8]。促炎因子白細(xì)胞介素(IL)1β、IL-6及腫瘤壞死因子(TNF)α是引起細(xì)胞因子風(fēng)暴的關(guān)鍵因子，利用其特異性抑制劑、阻斷劑遏制細(xì)胞因子風(fēng)暴一直是抗ALI藥物研究的熱點[9]。此外，糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)作為炎癥反應(yīng)的中樞激酶，是多條炎癥信號通路如NF-κB、p38及JNK信號通路相應(yīng)調(diào)節(jié)位點NF-κB p65、CREB及AP-1的共同靶分子，與ALI的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為抗ALI藥物篩選的新靶標(biāo)[10-11]。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選出涼膈散活性成分和作用靶點，預(yù)測其核心化合物及信號通路，再將核心化合物與IL-6、TNF-α、IL-1β及GSK-3β藥物靶點通過Auto Dock進(jìn)行分子對接，進(jìn)一步預(yù)測涼膈散抑制ALI細(xì)胞因子風(fēng)暴的分子機(jī)制，為涼膈散方及其單體成分多角度的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 涼膈散組方藥物活性成分及對應(yīng)靶點的篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)中對涼膈散所有組方藥物的化學(xué)成分進(jìn)行篩選[條件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18]，得到?jīng)鲭跎⒒钚猿煞旨跋嚓P(guān)的作用靶點。

1.2 ALI靶點收集

以“acute lung injury”為關(guān)鍵詞檢索人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(online mendelian inheritance in man，OMIM)和GeneCards數(shù)據(jù)庫，將結(jié)果匯總、分析，取交集，得到ALI疾病相關(guān)靶點基因。

1.3 藥物-疾病靶標(biāo)蛋白基因名確定、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及“中藥-化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫查詢“1.1”項與“1.2”項對應(yīng)的基因名，利用R軟件進(jìn)行交集分析，得到“疾病-藥物”共同靶點。將共同靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫，按最低相互作用得分(中等可信度：0.99)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。輸入涼膈散活性成分、共同靶點等至Cytoscape軟件，構(gòu)建“中藥-化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.4 基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

將“涼膈散-ALI”共同靶點用R軟件進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析，用Cytoscape軟件可視化靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

1.5 “成分-靶點”分子對接

通過ChemSpider數(shù)據(jù)庫篩選出的涼膈散核心化合物結(jié)構(gòu)，利用Chem3D軟件轉(zhuǎn)換為mol2格式。從RCSB數(shù)據(jù)庫下載IL-6(PDB:1P9M)、TNF-α(PDB:1NCF)、IL-1β(PDB:4DEP)和GSK-3β(PDB:1H8F)的3D結(jié)構(gòu)，在AutoDockTools中刪配體、去水、加氫及計算格點能等，最后使用VINA程序進(jìn)行分子對接。

2 結(jié)果

2.1 涼膈散組方藥物活性化合物收集

根據(jù)設(shè)置的篩選條件，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中收集到候選活性化合物共192個；來源于大黃16個，連翹23個，黃芩36個，甘草92個，梔子15個，薄荷10個(芒硝和竹葉均未檢索到化合物數(shù)據(jù))。其中，部分化合物存在于多種單味藥中，如木犀草素(luteolin)來源于連翹和薄荷，β-谷甾醇(beta-sitosterol)為黃芩、連翹、大黃和梔子共有。刪除重復(fù)活性成分后，共獲得候選活性化合物173種，其中，黃芩的新黃芩素(MOL002934)、連翹的連翹脂素(MOL003330)和甘草的甘草酚(MOL002311)的OB排序居前3位，均>90%；甘草的美迪紫檀素(MOL004924)、甘草醇F(MOL004988)和連翹的荷包牡丹堿(MOL000791)的DL排序居前3位，均≥0.88；此外，有159個(占90.34%)活性成分的腸上皮通透性(Caco-2)≥-0.4，提示涼膈散極易被小腸吸收利用。

2.2 “涼膈散-ALI”靶點收集及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中得到?jīng)鲭跎⒒钚猿煞?73個，其對應(yīng)靶點263個；從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫中得到ALI相關(guān)靶點6 400個，二者交集得到“涼膈散-ALI”共同靶點237個，見圖1。用237個共同靶點反向篩選涼膈散成分，剔除不作用于這237個靶點的成分，得到作用于ALI相關(guān)靶點的活性化合物149個。237個“涼膈散-ALI”共同靶點通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)見圖2。如圖所示，靶蛋白通過基因連線相互作用形成多中心相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，靶點蛋白節(jié)點連接數(shù)越高則在網(wǎng)絡(luò)中越重要，為核心靶點蛋白；AKT1、IL-6、MAPK3、VEGFA、JUN、EGFR、CASP3、MAPK8、EGF和MAPK1等10種靶蛋白連線最多，處于整個網(wǎng)絡(luò)的核心位置，提示上述靶蛋白與其他靶蛋白相互作用非常密切，在維持網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性和相互作用中起到重要作用，因此其編碼基因可能是“涼膈散-ALI”的核心靶點基因。將核心靶點蛋白按其連接數(shù)進(jìn)行排序，繪制成條形圖，見圖3。

圖1 涼膈散-ALI靶點交集韋恩圖Fig 1 Venn diagram of targets intersection of Liangge Powder-ALI

2.3 “中藥-化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

“中藥-化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)見圖4。在組方中藥方面，有11個化合物歸屬于2種以上藥材，以來源于甘草的化合物居多。在靶點蛋白方面，10.55%的靶點蛋白與≥20個化合物相互作用；作用≥30個化合物的靶點蛋白共23個。在化合物方面，20.81%化合物的靶點蛋白≥20個，其中8個化合物的靶點蛋白≥30個；靶點蛋白數(shù)排序居前3位的化合物分別為槲皮素、木犀草素和山柰酚，相關(guān)靶點蛋白數(shù)分別為130、52和50個。

圖中圓球表示靶點蛋白，連接線表示靶點蛋白間的相互作用關(guān)系the balls in the diagram indicate target proteins, and the connecting lines indicate the interactions between target proteins圖2 涼膈散-ALI靶點蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Diagram of PPI network of Liangge Powder-ALI target proteins

縱列為基因名，橫列為相應(yīng)基因連接數(shù)，如AKT1連接數(shù)為143the vertical column is gene name and the horizontal column is the corresponding gene linking number, e.g. the linking number of AKT1 is 143圖3 涼膈散-ALI核心靶標(biāo)的條形圖Fig 3 Bar chart of Liangge Powder-ALI core targets

2.4 GO功能、KEGG通路富集分析

(1)GO條目共2 755個(P<0.05)，其中生物過程條目2 433個(占 88.3%)，細(xì)胞組成條目112個(占4.1%)，分子功能條目210個(占7.6%)，說明237個靶點主要富集到生物過程，包括氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、細(xì)菌起源分子和營養(yǎng)水平等，富集的靶點數(shù)分別為58、57、57和57個。靶點數(shù)排序居前20位的條目見圖5。(2)KEGG通路共182條通路(P<0.05)，剔除疾病、廣義通路后發(fā)現(xiàn)237個靶點在炎癥免疫通路中富集明顯，如PI3K-Akt、TNF、IL-17及MAPK等通路，其富集的靶點數(shù)均≥25個。靶點數(shù)排序居前20位的通路氣泡圖見圖6。為了更加清晰地展示涼膈散治療ALI的作用機(jī)制，將“涼膈散-ALI”共同靶點和KEGG主要通路輸入Cytoscape，得到可視化靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，見圖7。結(jié)果顯示，1個靶點對應(yīng)多條通路，1條通路涉及多個靶點，其中有28個靶點富集到10條以上信號通路，涉及靶點數(shù)≥40個的信號通路有4條，表明涼膈散是通過多靶點、多通路作用于ALI。

2.5 涼膈散核心活性化合物與IL-6、TNF-α、IL-1β和GSK-3β的分子對接結(jié)果

普遍認(rèn)為，結(jié)合能越低，配體與受體越可能結(jié)合發(fā)揮作用，當(dāng)兩者結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol時結(jié)合較好。將涼膈散核心活性化合物與IL-6(PDB:1P9M)、TNF-α(PDB:1NCF)、IL-1β(PDB:4DEP)和GSK-3β(PDB:1H8F)進(jìn)行對接，相應(yīng)結(jié)合能均≤-5.0 kJ/mol，說明涼膈散核心活性化合物與上述受體有較好的結(jié)合能力(見表1)。其中，與IL-6結(jié)合能較低的3個化合物為連翹苷、豆甾醇和光甘草定；與TNF-α結(jié)合能較低的3個化合物為連翹苷、豆甾醇和β-谷甾醇；與IL-1β結(jié)合能較低的3個化合物為連翹苷、豆甾醇和攀紫檀素；與GSK-3β結(jié)合能較低的3個化合物為連翹苷、豆甾醇和1-甲氧基菜青素。將目前臨床使用的幾種抗炎藥與IL-6、TNF-α、IL-1β和GSK-3β受體進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)涼膈散核心化合物中連翹苷與上述4種受體的結(jié)合能均小于臨床使用的幾種抗炎藥。連翹苷與4種受體對接模式見圖8。

表1 涼膈散中核心化合物及目前臨床常見抗炎藥與IL-6、TNF-α、IL-1β和GSK-3β的結(jié)合能Tab 1 Binding energy of core components in Liangge Powder and clinically used anti-inflammatory drugs with IL-6, TNF-α, IL-1β and GSK-3β

圖中正中4個圓環(huán)代表涼膈散-ALI共同靶標(biāo)；其余代表涼膈散各單味中藥的核心成分the four circles in the middle of diagram represent common target of Liangge Powder-ALI; the rest represent core components of each single flavour of Liangge Powder圖4 “中藥-化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 4 Interaction network of herbal-compound-target

3 討論

涼膈散出自《太平惠民和劑局方》，是清上瀉下治法的代表方。連翹清熱解毒，黃芩清胸隔郁熱，以為君；桅子通瀉三焦，大黃和芒硝攻積泄熱、逐瘀通經(jīng)，三藥共為臣；薄荷、竹葉疏散瀉火、透熱于外，皆為佐；甘草和諸藥，是為使；全方上疏胸膈邪熱，下通中焦滯熱，清泄結(jié)合，用于上中二焦火熱證候。著名中西醫(yī)結(jié)合急救醫(yī)學(xué)專家王今達(dá)[12]依據(jù)“肺與大腸相表里”理論，運用清上瀉下、解毒排毒之法，以涼膈散治療ALI/ARDS，80%的重癥患者痊愈。涼膈散作為集清熱解毒、通腑瀉下兩法為一體的經(jīng)典方劑，其作用機(jī)制也是多重的。過往僅針對某一靶點或途徑通過實驗方法逐一篩選藥物作用靶點與機(jī)制的研究方式存在盲目主觀、費時低效且缺乏整體觀的缺點，使得中醫(yī)藥的綜合治療作用難以得到詮釋。利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)對涼膈散治療ALI進(jìn)行系統(tǒng)的預(yù)測分析，從“成分-靶點-通路”的研究理念出發(fā)，可為涼膈散及其單體成分的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

氣泡大小表示基因數(shù)目，橫列數(shù)字表示基因比例，不同氣泡代表不同P值，富集程度越高則P值越小the size of bubble indicates the number of gene, the number in horizontal column indicates the proportion of genes, different bubbles represent different P-values, the higher the enrichment level the smaller the P-value圖5 涼膈散-ALI關(guān)鍵靶點GO功能富集分析Fig 5 GO function enrichment analysis of key targets of Liangge Powder-ALI

氣泡大小表示基因數(shù)目，橫列數(shù)字表示基因比例，不同氣泡代表不同P值，富集程度越高則P值越小the size of bubble indicates the number of gene, the number in horizontal column indicates the proportion of genes, different bubbles represent different P-values, the higher the enrichment level the smaller the P-value圖6 涼膈散-ALI關(guān)鍵靶點KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Liangge Powder-ALI

大圓環(huán)代表化合物與疾病共同靶點，小圓環(huán)代表前20位信號通路Large circles represent common targets of compounds and diseases, small circles represent top 20 signaling pathways圖7 靶點-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig 7 Network of interaction of target-pathway

A.連翹苷與IL-6受體對接模式；B.連翹苷與TNF-α受體對接模式；C.連翹苷與IL-1β受體對接模式；D.連翹苷與GSK-3β受體對接模式A.molecular docking patterns of phillyrin with IL-6；B.molecular docking patterns of phillyrin with TNF-α；C.molecular docking patterns of phillyrin with IL-1β；D.molecular docking patterns of phillyrin with GSK-3β圖8 連翹苷分別與IL-6、TNF-α、IL-1β和GSK-3β的分子對接模式Fig 8 Molecular docking patterns of phillyrin with IL-6, TNF-α, IL-1β and GSK-3β

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)從TCMSP中得到?jīng)鲭跎⒒钚曰衔?73個，相對應(yīng)靶點263個，其中90.34%的活性化合物極易被小腸吸收，說明涼膈散適合作為口服藥物使用；90.11%的作用靶點與ALI有關(guān)，揭示涼膈散治療ALI的合理性、有效性。在PPI網(wǎng)絡(luò)、靶點-通路網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)中心位置的靶點AKT1、IL-6等在ALI發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可能是涼膈散治療ALI的核心靶點。AKT1屬于AKT激酶家族，由PI3K激活，活化的AKT磷酸化下游靶蛋白GSK-3β、IKKα及Tpl2等調(diào)控NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、肺泡凝血和纖溶等[10-11]。IL-6是細(xì)胞因子風(fēng)暴的核心炎癥因子，是急性感染和炎癥損傷的早期靈敏指標(biāo)。“中藥-化合物-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示，槲皮素、山柰酚、木犀草素、柚皮素和漢黃連素存在于涼膈散的多個單味藥中，其相應(yīng)的連接核心靶點數(shù)排序居前10位，且均已被證實與抗炎、抗菌及免疫調(diào)節(jié)等密切相關(guān)，是該方的核心成分[13-16]。GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)核心靶點主要富集生物過程，KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt、TNF和IL-17等多條炎癥免疫信號通路富集明顯，而阻斷這些信號通路可明顯抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴，減輕ALI[17-19]。從分子對接分析結(jié)果可知，核心化合物與IL-6、TNF-α、IL-1β和GSK-3β受體的結(jié)合能均遠(yuǎn)<-5.0 kJ/mol，其中，連翹中的連翹苷結(jié)合能比臨床常用強抗炎藥地塞米松還低，說明連翹苷與上述受體均有較好的結(jié)合活性。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù)，首次對溫病治療名方?jīng)鲭跎⒅委烝LI的活性成分與分子機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)測，推測其潛在機(jī)制為：涼膈散活性成分一方面抑制GSK-3β活性，減少NF-κB p65活化，下調(diào)促炎因子表達(dá)，同時增加CREB和AP-1轉(zhuǎn)錄，上調(diào)抗炎因子表達(dá)，維持體內(nèi)促炎與抗炎平衡，從而減輕機(jī)體炎癥損傷；另一方面競爭性地與IL-6、TNF-α和IL-1β受體結(jié)合，減少IL-6、TNF-α和IL-1β釋放，進(jìn)而抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴，避免炎癥級聯(lián)反應(yīng)對肺部的進(jìn)一步損傷，改善ALI的臨床癥狀。