李曾一，王 松，高 宛，林玉玲

1)南陽(yáng)市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南南陽(yáng) 473000 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450052

糖尿病腎病是一種臨床上常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，遺傳學(xué)因素、氧化應(yīng)激等是誘發(fā)糖尿病腎病的主要因素[1]。有研究[2]表明，腎小管上皮細(xì)胞損傷是糖尿病腎病進(jìn)展的關(guān)鍵，高血糖能夠誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞氧化損傷，進(jìn)而造成腎小管組織功能異常。線(xiàn)粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)是一種與線(xiàn)粒體分裂相關(guān)的蛋白，在人類(lèi)新生兒發(fā)育中具有重要作用[3-4]。有研究[5-6]顯示，糖尿病腎病中Drp1表達(dá)水平異常升高，Drp1參與阿德福韋誘發(fā)的腎小管上皮細(xì)胞功能損傷。本次實(shí)驗(yàn)以腎小管上皮細(xì)胞HK-2為研究對(duì)象，探討Drp1在高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料HK-2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，炎性小體NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3,NLRP3)抗體、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海一研生物科技有限公司，Drp1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)抗體購(gòu)自美國(guó)CTS公司，SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，Trizol試劑購(gòu)自上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司，Drp1 siRNA慢病毒和陰性對(duì)照慢病毒由山東解螺旋生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 高糖對(duì)腎小管上皮細(xì)胞中Drp1表達(dá)的影響HK-2細(xì)胞分別培養(yǎng)于葡萄糖濃度為5.5、30.0 mmol/L的培養(yǎng)液中，記為正常對(duì)照組、高糖組，培養(yǎng)24 h后使用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Drp1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。

Real-time PCR：用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。取5 μg總RNA樣品，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃保存。PCR引物由南京金斯瑞公司合成，引物序列：GAPDH上游引物5’-GGTCACCAGGGCTGCTTTT-3’，下游引物 5’-ATCGCCCCACTTGATTTTG-3’；Drp1上游引物 5’-TGCTGTGGACTTGAGTTGGG-3’，下游引物5’-GGCTGGGTTTGTCGGTGTT-3’。按照SYBR Green PCR試劑盒說(shuō)明步驟進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2.0 μL cDNA，上、下游引物各1.0 μL，12.5 μL SYBR Green PCR Master Mix，8.5 μL dH2O。反應(yīng)程序：90 ℃ 30 s;95 ℃3 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。讀取Ct值，以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果用2-ΔΔCt法計(jì)算。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Western blot：在細(xì)胞中分別添加含PMSF的RIPA裂解液，振蕩混勻，在冰上充分裂解，4 ℃12 000 ×g離心10 min，用移液槍把上清液轉(zhuǎn)移到EP管中，-20 ℃保存。采用BCA法對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。蛋白樣品中添加上樣緩沖液并煮沸變性，每個(gè)泳道上樣30 μg，轉(zhuǎn)膜后將PVDF膜以50 g/L脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，加Drp1抗體(1∶600稀釋)，室溫下反應(yīng)2 h，加1∶3 000稀釋的二抗，室溫結(jié)合2 h，ECL法發(fā)光。Image J分析條帶的灰度值，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 Drp1 siRNA干擾效果檢測(cè)將HK-2細(xì)胞接種于24孔板，每孔接種2×105個(gè)細(xì)胞。顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度為40%～50%時(shí)，每孔添加1 mL Drp1 siRNA慢病毒液或陰性對(duì)照慢病毒液(MOI=20)，孵育12 h后取出培養(yǎng)板，加入新的培養(yǎng)液。3 d后，用Puromycin篩選3周，挑選抗性細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。分別將穩(wěn)定感染Drp1 siRNA慢病毒、陰性對(duì)照慢病毒的細(xì)胞置于高糖(葡萄糖濃度為30.0 mmol/L)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)，記為L(zhǎng)v-si Drp1+高糖組和Lv-NC+高糖組，未感染僅以高糖細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞為高糖組。用Real-time PCR和Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Drp1 mRNA和蛋白的表達(dá)，以驗(yàn)證干擾效果，步驟同1.2。

1.4 Drp1 siRNA干擾對(duì)高糖環(huán)境下HK-2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、凋亡及炎癥因子表達(dá)的影響將穩(wěn)定感染Drp1 siRNA慢病毒或陰性對(duì)照慢病毒的HK-2細(xì)胞用高糖(葡萄糖濃度30.0 mmol/L)培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為L(zhǎng)v-si Drp1+高糖組和Lv-NC+高糖組；未感染細(xì)胞分別用葡萄糖濃度為5.5、30.0 mmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別記為正常對(duì)照組、高糖組。

培養(yǎng)24 h后，收集上述4組細(xì)胞，用1×PBS洗滌2次，添加150 μL緩沖液后先加10 μL Annexin V-FITC，再加5 μL PI，混勻，室溫、避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

收集上述4組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后的培養(yǎng)液上清，按照硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA水平，用黃嘌呤氧化法檢測(cè)SOD活性，用二硝基苯肼比色法檢測(cè)LDH水平，用ELISA法檢測(cè)IL-1β水平，步驟均參照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

培養(yǎng)24 h后收集上述4組細(xì)胞，用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和NLRP3蛋白的表達(dá)水平，步驟同1.2，一抗稀釋度均為1∶600。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較正常對(duì)照組與高糖組 Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異；采用單因素方差分析比較高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的差異；正常對(duì)照組、高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組細(xì)胞凋亡率，SOD、MDA、LDH及IL-1β分泌量，以及細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和NLRP3蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 高糖對(duì)HK-2細(xì)胞中Drp1表達(dá)的影響結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。與正常對(duì)照組比較，高糖組細(xì)胞中Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高。

1：正常對(duì)照組；2：高糖組

表1 2組細(xì)胞中Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.2 Drp1 siRNA的干擾效果結(jié)果見(jiàn)圖2和表2。與其他2組比較，Lv-si Drp1+高糖組細(xì)胞中Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低。

1～3：分別為高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組

表2 3組細(xì)胞中Drp1 mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

2.3 4組HK-2細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、凋亡及炎癥因子表達(dá)的比較結(jié)果見(jiàn)圖3，表3、4。與正常對(duì)照組比較，高糖組和Lv-NC+高糖組細(xì)胞凋亡率升高，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(圖3A)，MDA、LDH分泌增加，SOD分泌減少，IL-1β分泌增加，細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)水平升高；與高糖組和Lv-NC+高糖組比較，Lv-si Drp1+高糖組細(xì)胞凋亡率降低，Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低，MDA、LDH分泌減少，SOD分泌增加，細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)水平降低(圖3B)，IL-1β分泌減少。

1～4:分別為正常對(duì)照組、高糖組、Lv-NC+高糖組、Lv-si Drp1+高糖組

表3 4組細(xì)胞的凋亡率及Cleaved Caspase-3、NLRP3蛋白表達(dá)水平的比較(n=3)

表4 4組細(xì)胞SOD、MDA、LDH、IL-1β分泌量的比較(n=3)

3 討論

高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷模型是十分常見(jiàn)的糖尿病腎病細(xì)胞體外模型[7-9]。Caspase-3是Caspase凋亡反應(yīng)的下游執(zhí)行因子，其只有被活化后才可以發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[10]。本實(shí)驗(yàn)表明，高糖刺激后腎小管上皮細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中活化的Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，說(shuō)明構(gòu)建了高糖腎小管上皮細(xì)胞損傷體外模型。

Drp1在多種生物體中存在且高度保守。人類(lèi)Drp1基因定位在12號(hào)染色體上。Drp1蛋白由699個(gè)氨基酸組成，含有保守的中間結(jié)構(gòu)域、裝配域及含GTP酶結(jié)構(gòu)的N端，多以多聚體的形式存在于胞漿中，參與細(xì)胞運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡等過(guò)程[11-13]。野生型Drp1可以促進(jìn)高糖條件下胰島β細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷；高糖刺激后人動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中Drp1表達(dá)上調(diào)，Drp1沉默可以改善高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞線(xiàn)粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，提高一氧化氮利用度[14-15]。研究[5,16]顯示，Drp1在糖尿病腎病小鼠腎組織內(nèi)表達(dá)上調(diào)，白藜蘆醇干預(yù)可以降低腎組織內(nèi)Drp1的表達(dá)，改善糖尿病腎病腎組織損傷。本實(shí)驗(yàn)表明，高糖刺激后腎小管上皮細(xì)胞Drp1表達(dá)增強(qiáng)，說(shuō)明Drp1有可能與高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷有關(guān)。

高糖刺激后的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生氧化損傷以及炎性損傷是糖尿病腎病發(fā)生的重要機(jī)制；正常情況下細(xì)胞中氧化還原平衡的維持與細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性有關(guān)，SOD是氧自由基清除劑，其活性降低能夠直接導(dǎo)致細(xì)胞中氧自由基的積累，引起細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化，生成MDA。由于脂質(zhì)是細(xì)胞膜的主要組成部分，過(guò)量的氧自由基通過(guò)這種作用破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞釋放LDH等物質(zhì)至細(xì)胞外[17-20]。此外，氧化應(yīng)激往往伴隨有炎癥反應(yīng)，NLRP3是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的炎性小體，可被細(xì)胞內(nèi)氧自由基激活，促進(jìn)炎癥因子IL-1β的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞炎性損傷[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，下調(diào)Drp1可以抑制高糖刺激的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提高SOD的分泌，減少M(fèi)DA、LDH和IL-1β的分泌，下調(diào)細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)，說(shuō)明下調(diào)Drp1能夠減輕高糖刺激下的腎小管上皮細(xì)胞損傷，其作用機(jī)制可能與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。

總之，下調(diào)Drp1能夠減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡，減輕高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞炎性損傷，這對(duì)于研究糖尿病腎病具體的分子機(jī)制有重要意義，后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)在原代腎小管上皮細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。