任會(huì)均，馬小涵，彭若玉，李 藝，明 亮

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科；河南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

血流感染是臨床各科常見(jiàn)的一類疾病，多發(fā)生于機(jī)體免疫力低下、抗生素濫用、激素等藥物不合理使用等情況下，若病情得不到及時(shí)、有效的控制，可進(jìn)一步發(fā)展為膿血癥甚至休克、死亡，對(duì)患者的生命安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅[1]。對(duì)于此類感染性疾病，及早明確病原體類型并進(jìn)行病因治療非常重要[2]。目前，血培養(yǎng)是感染診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但其受標(biāo)本質(zhì)量、培養(yǎng)條件等多種因素的影響，存在靈敏度不高、培養(yǎng)周期長(zhǎng)、陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)[3]，在感染早期診斷中的應(yīng)用具有一定的局限性。細(xì)胞因子是一類具有細(xì)胞活性的小分子蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量小于40 000)，由各種細(xì)胞以自分泌或旁分泌等方式產(chǎn)生，發(fā)揮內(nèi)臟活動(dòng)、免疫調(diào)節(jié)等多種功能[4]。其中，Th1/Th2細(xì)胞因子分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫，作為機(jī)體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的代表，可從整體上對(duì)機(jī)體免疫功能進(jìn)行評(píng)估。近年來(lái)Th1/Th2細(xì)胞因子在自身免疫性及感染性疾病診斷、治療方面的價(jià)值逐漸被關(guān)注，如IL-6、IL-10及降鈣素原(PCT)聯(lián)合用于血液腫瘤患兒膿毒性休克的預(yù)測(cè)[5]。流式微球分析技術(shù)(cytometric bead array，CBA)是以熒光微球?yàn)檩d體，通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)樣本中的多個(gè)蛋白同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析的方法，具有高通量、高靈敏性、高特異性、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、檢測(cè)快速等優(yōu)勢(shì)，尤其在細(xì)胞因子檢測(cè)方面優(yōu)勢(shì)顯著[6]。本研究采用流式CBA檢測(cè)血流感染患者血漿Th1/Th2細(xì)胞因子水平，探討其在不同病原體感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值，為臨床合理用藥提供指導(dǎo)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象收集2018年1月至10月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸科、感染科住院的患者，結(jié)合病史及血培養(yǎng)結(jié)果，確定170例感染患者納入本研究(血培養(yǎng)陽(yáng)性組)，患者年齡18～80歲，其中男72例，女98例。170例患者中革蘭陽(yáng)性菌(G+)感染56例，包括金黃色葡萄球菌25例、其他葡萄球菌10例、鏈球菌6例、腸球菌9例、其他G+菌6例；革蘭陰性菌(G-)感染84例，包括大腸埃希菌31例，肺炎克雷伯桿菌23例，銅綠假單胞菌7例，鮑曼不動(dòng)桿菌5例，腸桿菌屬5例，其他G-菌13例；真菌感染30例。另收集同時(shí)期皰疹病毒、EB病毒感染患者35例(病毒組)，選取健康體檢者280例(健康對(duì)照組)。各組間性別、年齡等基本資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2019-KY-171)。

1.2 血漿Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)利用EDTA抗凝管采集患者靜脈血，室溫3 000×g離心20 min，分離血漿，對(duì)Th1細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)和Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)進(jìn)行熒光標(biāo)記，Th1/Th2細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州賽基生物科技有限公司。采用BD FACS Canto Ⅱ 流式細(xì)胞儀對(duì)血漿細(xì)胞因子含量進(jìn)行檢測(cè)，以上6種細(xì)胞因子檢測(cè)的上、下限分別為5 000.0、1.0 ng/L。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。應(yīng)用Shapiro-Wilk方法對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(第25，75百分位數(shù)) [M(P25,P75)]表示，應(yīng)用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)比較多組間Th1/Th2細(xì)胞因子水平的差異，采用Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較。繪制ROC并計(jì)算曲線下面積(AUC)，評(píng)價(jià)各細(xì)胞因子的診斷效能，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組血漿中Th1/Th2細(xì)胞因子水平比較見(jiàn)表1。3組間IL-2水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余5種細(xì)胞因子組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析(表2)顯示，與健康對(duì)照組相比，G+組患者血漿中TNF-α、IL-6及IL-10水平升高；G-組IFN-γ、TNF-α、IL-6及IL-10水平升高；真菌組IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-10均升高(P<0.05)(表2)。對(duì)血培養(yǎng)陽(yáng)性組內(nèi)進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，G-組TNF-α、IL-6、IL-10的水平高于G+組；真菌組IFN-γ、IL-10的水平高于G+組(P<0.05)；而G-組與真菌組相比僅IFN-γ差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 各組患者血漿中細(xì)胞因子水平的比較 ng/L

表2 血培養(yǎng)陽(yáng)性組患者與健康對(duì)照組血漿中細(xì)胞因子水平的比較 ng/L

2.2 Th1/Th2細(xì)胞因子對(duì)血流感染的診斷價(jià)值見(jiàn)圖1和表3。圖1和表3可知，除IL-2以外，IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均可用于預(yù)測(cè)血流感染)，其中IL-6與IL-10均具有較高的AUC，但兩者之間的診斷效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.176，P=0.240)。對(duì)IL-6和IL-10進(jìn)行聯(lián)合分析，其AUC為0.997(95%CI:0.993～1.000，P<0.01)，靈敏度、特異度為0.982、0.996；與IL-6單項(xiàng)診斷相比較，診斷效能與靈敏度稍高。

圖1 各細(xì)胞因子預(yù)測(cè)血流感染的ROC曲線

2.3 各細(xì)胞因子在區(qū)分G+菌/G-菌/真菌感染中的價(jià)值

表3 Th1/Th2細(xì)胞因子對(duì)于血流感染的預(yù)測(cè)價(jià)值參數(shù)

2.3.1各細(xì)胞因子區(qū)分G+菌/G-菌感染的價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，TNF-α、IL-6、IL-10對(duì)于區(qū)分G-菌和G+菌感染均具有診斷價(jià)值(AUC>0.5且P<0.05)，IL-6與IL-10之間的診斷效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.258，P=0.796)，IL-10的診斷效能高于TNF-α(Z=2.968，P=0.003)，IL-6的診斷效能高于TNF-α(Z=2.924，P=0.004)。因此，IL-10和IL-6對(duì)于區(qū)分G+菌、G-菌感染具有更高的診斷效能，其中，IL-6靈敏度最高，IL-10特異度最高(表4)。

表4 各細(xì)胞因子區(qū)分G+菌/G-菌感染的價(jià)值參數(shù)

2.3.2各細(xì)胞因子區(qū)分G+菌/真菌感染的價(jià)值 ROC曲線分析顯示，IFN-γ、IL-6、IL-10對(duì)于區(qū)分G+菌和真菌感染均具有診斷價(jià)值(AUC>0.5且P<0.05)，IL-6與IL-10之間的診斷效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=0.646，P=0.519)，IFN-γ與IL-6之間的診斷效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.324，P=0.186)，IFN-γ的診斷效能高于IL-10(Z=2.625，P=0.009)。因此，IFN-γ對(duì)于區(qū)分G+菌、真菌感染具有更高的診斷效能，它的靈敏度最高(表5)。

表5 各細(xì)胞因子區(qū)分G+菌/真菌感染的價(jià)值參數(shù)

2.3.3各細(xì)胞因子區(qū)分G-菌/真菌感染的價(jià)值 ROC曲線結(jié)果顯示，IFN-γ的診斷效能高于IL-6(Z=2.257，P=0.024)。因此，IFN-γ對(duì)于區(qū)分G-菌、真菌感染具有更高的診斷效能，它的靈敏度最高(表6)。

表6 各細(xì)胞因子區(qū)分G-菌/真菌感染的價(jià)值參數(shù)

2.4 IL-6與IFN-γ在預(yù)測(cè)血流感染中的應(yīng)用價(jià)值G-組患者血漿中IL-6的水平與G+組、真菌組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且表達(dá)水平為：G-組>真菌組>G+組。將血流感染組分為G-組和非G-組，ROC曲線分析顯示，IL-6的AUC為0.769(95%CI: 0.700～0.838，P<0.05)，靈敏度、特異度分別為0.857、0.570。

真菌組患者血漿中IFN-γ的水平與G+組、G-組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(P<0.05)，且在真菌組中表達(dá)水平最高。將血流感染組分為真菌組和非真菌組，ROC曲線分析顯示，IFN-γ的AUC為0.808(95%CI:0.741～0.874，P<0.01)，靈敏度、特異度分別為0.933、0.664。

2.5 細(xì)胞因子在預(yù)測(cè)病毒感染中的價(jià)值以靈敏度為縱坐標(biāo)，以(1-特異度)為橫坐標(biāo)，對(duì)病毒組和健康對(duì)照組進(jìn)行ROC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNF-α、IL-2、IL-4無(wú)診斷價(jià)值(P>0.05)；IFN-γ、IL-6、IL-10的AUC分別為：0.602(95%CI:0.485～0.718，P=0.049)，0.608(95%CI:0.519～0.698，P=0.037)，0.604(95%CI:0.531～0.677，P=0.048)，但它們的診斷效能、靈敏度、特異度均不高。

3 討論

感染是指細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等病原體侵入人體所引起的局部組織和全身性炎癥反應(yīng)。各種病原微生物侵入機(jī)體血液循環(huán)，釋放毒素或代謝產(chǎn)物，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的釋放及炎癥反應(yīng)，患者從而出現(xiàn)不同程度的臨床表現(xiàn)，如發(fā)熱、全身感染、中毒、膿毒癥甚至休克，嚴(yán)重影響患者的治療及預(yù)后[7]。對(duì)于疑似感染病例，臨床醫(yī)生通常結(jié)合患者體征、實(shí)驗(yàn)室檢查等進(jìn)行判斷，進(jìn)而經(jīng)驗(yàn)性使用廣譜抗生素或者根據(jù)相關(guān)指南進(jìn)行用藥，但目前臨床上普遍存在抗生素濫用現(xiàn)象，結(jié)果導(dǎo)致了耐藥菌譜的逐年擴(kuò)大，甚至是超級(jí)耐藥菌的出現(xiàn)，這不僅造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)，更增大了感染者治療的難度及死亡風(fēng)險(xiǎn)。因此，及時(shí)對(duì)感染做出明確診斷，合理選取抗生素進(jìn)行抗感染治療十分重要。

目前，臨床用于輔助診斷感染的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)主要包括血培養(yǎng)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、PCT、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞比例及紅細(xì)胞沉降率等，但血培養(yǎng)周期長(zhǎng)，對(duì)于較難生長(zhǎng)的病原菌或已經(jīng)經(jīng)過(guò)抗生素治療的患者標(biāo)本，敏感性較差；CRP對(duì)感染診斷的靈敏度雖較高，但特異度低且存在延遲反應(yīng)；PCT對(duì)局部細(xì)菌感染的診斷價(jià)值不理想等，因此，目前傳統(tǒng)指標(biāo)存在特異性差、早期診斷不靈敏、易受其他因素影響等缺點(diǎn)[8]。

細(xì)胞因子是由細(xì)胞產(chǎn)生的小分子活性蛋白，通過(guò)旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式參與多種生理和病理過(guò)程。Th1/Th2細(xì)胞因子的平衡在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的作用，分別介導(dǎo)細(xì)胞免疫及體液免疫[9]。在多種病原微生物感染、自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中，Th1/Th2細(xì)胞因子均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[10-11]。當(dāng)病原微生物及其毒素侵入血液循環(huán)，激活宿主的細(xì)胞和體液免疫系統(tǒng)，大量的細(xì)胞因子釋放，發(fā)揮促炎或抗炎等作用，以期恢復(fù)機(jī)體的免疫平衡。本研究以血流感染(G+/G-/真菌)患者為研究對(duì)象，以皰疹病毒及EB病毒感染者、健康體檢者為對(duì)照組，檢測(cè)G+/G-/真菌患者血漿中Th1/Th2細(xì)胞因子的水平，比較各組間細(xì)胞因子水平的差異并分別進(jìn)行ROC分析及聯(lián)合分析，評(píng)價(jià)它們對(duì)感染與否及不同病原菌的鑒別診斷價(jià)值。

本研究應(yīng)用流式CBA技術(shù)對(duì)血漿細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)。CBA是利用熒光高分子微球?yàn)檩d體，用抗原特異性單抗進(jìn)行包被，之后與樣本及熒光素標(biāo)記的抗原特異性單抗(檢測(cè)抗體)反應(yīng)，然后采用流式細(xì)胞儀對(duì)樣本血漿中的細(xì)胞因子進(jìn)行定量測(cè)定[12]。以往臨床常采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，但由于細(xì)胞因子表達(dá)量在pg級(jí)水平，含量極低，不易檢測(cè)，故ELISA方法存在敏感度不夠、準(zhǔn)確性差、重復(fù)性不好等不足，而CBA技術(shù)利用熒光微球的“放大”效應(yīng)，使得細(xì)胞因子的檢測(cè)具有更高的靈敏性、特異性以及可重復(fù)性[13]。

既往研究[14]顯示IFN-γ可誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡，抑制T細(xì)胞的分化，從而發(fā)揮抗炎作用，維持機(jī)體的免疫平衡。IL-2是促進(jìn)T細(xì)胞增殖的主要細(xì)胞因子，同時(shí)還可激活NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)、巨噬細(xì)胞以及B細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[15]。TNF-α主要由激活的單核巨噬細(xì)胞合成分泌，具有較強(qiáng)的促炎作用[16]。IL-4具有抗炎作用，其通過(guò)誘導(dǎo)漿細(xì)胞分化產(chǎn)生抗體從而參與體液免疫應(yīng)答[17]。IL-6是一種促炎因子，可募集單核細(xì)胞，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化和凋亡，在宿主防御病原體和急性應(yīng)激中起著舉足輕重的作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，血流感染患者血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10的水平明顯高于健康對(duì)照組，這是由于病原菌侵入血流后，刺激機(jī)體T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等增殖、活化，大量的細(xì)胞因子產(chǎn)生并釋放，導(dǎo)致血漿中細(xì)胞因子水平顯著增高。ROC曲線分析顯示，血流感染組IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10均可用于預(yù)測(cè)血流感染，其中，IL-6、IL-10的AUC顯著高于IFN-γ、TNF-α、IL-4，且具有更高的靈敏度、特異度，提示 IL-6、IL-10對(duì)于預(yù)測(cè)病原菌血流感染具有更高的應(yīng)用價(jià)值，但兩者的診斷效能差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將IL-6、IL-10聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，其靈敏度、特異度均略高于IL-6，臨床可采用IL-6、IL-10聯(lián)合方案對(duì)血流感染進(jìn)行預(yù)測(cè)。

對(duì)不同類型病原菌感染組間的統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，G-菌感染組IL-6水平高于非G-感染組，其機(jī)制可能是G-菌的胞壁肽和內(nèi)毒素刺激單核巨噬細(xì)胞等釋放大量的IL-6，從而導(dǎo)致血漿中IL-6的升高。ROC曲線分析顯示，IL-6在鑒別G-菌感染中具有較高的診斷效能，且靈敏度較高(85.7%)。由于IL-6在G-菌感染后2 h內(nèi)迅速出現(xiàn)，具有反應(yīng)靈敏、半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)[19]，故本研究認(rèn)為IL-6可作為G-菌感染的重要診斷指標(biāo)。

對(duì)真菌組與細(xì)菌(G+菌/G-菌)組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，真菌組患者血漿IFN-γ的水平顯著高于細(xì)菌組。這與既往研究發(fā)現(xiàn)一致，真菌感染可導(dǎo)致機(jī)體血清IFN-γ水平升高，但具體機(jī)制尚不明確，推測(cè)可能由于真菌感染可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免疫，特異性CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的IFN-γ等細(xì)胞因子，從而激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、CTL，參與真菌的殺滅。進(jìn)一步ROC曲線分析顯示，IFN-γ對(duì)于真菌感染有較好的診斷效能，且靈敏度較高，對(duì)真菌感染具有提示作用。

綜上所述，血流感染患者存在Th1/Th2細(xì)胞因子表達(dá)的失衡，血漿中IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-10增高，其中IL-6、IL-10用于預(yù)測(cè)血流感染具有更高的價(jià)值，且IL-6可作為G-菌感染的重要診斷指標(biāo)，另外IFN-γ對(duì)于真菌感染具有提示作用。本研究對(duì)血流感染患者血漿Th1/Th2細(xì)胞因子譜的檢測(cè)，對(duì)于血流感染及病原菌類型的預(yù)測(cè)具有提示作用，有利于臨床進(jìn)行感染的早期診斷和合理用藥。