何謙益，石曉娟，連晶瑤，劉莎莎，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤中心 鄭州 450052 4)河南省腫瘤免疫與生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 5)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

卒中是腦血管病的一種，其中87%為缺血性卒中，也被稱為腦梗死。卒中是全球范圍內(nèi)造成患者死亡與致殘的主要原因，全球每年新增1 030萬(wàn)卒中患者[1]。目前唯一被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)使用并且在臨床使用中被證實(shí)有效的治療腦梗死的藥物是重組組織纖溶酶原激活劑(tPA)。但是由于tPA治療時(shí)間窗僅為發(fā)病后4.5 h內(nèi)，且并不能阻斷缺血后免疫損傷，因此其并不能廣泛地降低急性腦梗死的致死率與致殘率。人們?nèi)孕鑼ふ倚碌募毙阅X梗死的治療策略。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究關(guān)注于急性腦梗死后的免疫反應(yīng)，已有證據(jù)[2-3]表明在腦梗死后誘導(dǎo)免疫抑制可以起到神經(jīng)保護(hù)的作用。

在T細(xì)胞受體被抗原激活的同時(shí)許多共抑制分子也被激活以達(dá)到精確調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)度的目的，這些共抑制分子又被稱為免疫檢查點(diǎn)[4]。免疫檢查點(diǎn)不僅參與維持機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受，而且還能有效地防止免疫過(guò)度激活，從而減輕炎癥性組織損傷[5]。既往研究表明，免疫檢查點(diǎn)T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3[6](T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3,Tim-3)、程序性細(xì)胞死亡蛋白-1[7](programmed cell death protein-1,PD-1)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4[8](cytotoxic T-lymphocyte antigen-4，CTLA-4)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中起重要的免疫抑制作用。研究[9]表明CD8+T細(xì)胞可能早在腦梗死發(fā)生3 h后就開(kāi)始在梗死灶周邊聚集。不同于CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞主要通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶促進(jìn)腦梗死后的炎癥反應(yīng)[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)急性腦梗死患者外周CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4的表達(dá)，分析上述免疫檢查點(diǎn)分子陽(yáng)性率與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2018年11月至2019年11月經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的急性腦梗死患者，共108例。選取同時(shí)期至該院體檢科體檢健康的90人作為健康對(duì)照。研究對(duì)象均自愿參加本研究并且簽署了知情同意書(shū)。急性腦梗死患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：①符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并且均經(jīng)MRI檢查確認(rèn)。②神經(jīng)缺損癥狀首次出現(xiàn)，且在發(fā)病7 d內(nèi)就診。排除標(biāo)準(zhǔn)為：①妊娠或合并其他重要臟器功能不全者。②近期應(yīng)用過(guò)免疫抑制劑、類固醇等藥物。③患有自身免疫性疾病、感染性疾病、癌癥等可能影響免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的疾病。

1.2 臨床資料的收集采集研究對(duì)象的臨床資料，如性別、年齡、糖尿病病史、高血壓病史、房顫病史、吸煙史、冠心病病史、飲酒史等。采集患者入院當(dāng)天或第2天清晨空腹靜脈血，運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol， HDL-C)、甘油三酯、總膽固醇等。急性腦梗死患者均接受了為期90 d的隨訪，隨訪結(jié)束后應(yīng)用modified Rankin Scale(mRS)評(píng)分評(píng)價(jià)預(yù)后，0～2分為預(yù)后好，3～5分為預(yù)后差。

1.3 CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3與CTLA-4表達(dá)的檢測(cè)取空腹靜脈血10 mL，抗凝后采用梯度-密度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。PBMC計(jì)數(shù)后取1×106個(gè)，用FACS Buffer重懸后避光加入流式抗體，包括anti-CD3、anti-CD8、anti-PD-1、anti-Tim-3和anti-CTLA-4 (Biolegend公司產(chǎn)品)，4 ℃避光孵育30 min后上流式細(xì)胞儀(BD FACS-Canto Ⅱ) 檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 23.0進(jìn)行分析。兩組臨床資料比較采用t/χ2檢驗(yàn)。兩組外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4表達(dá)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Logistic回歸分析急性腦梗死患者預(yù)后的影響因素。繪制ROC曲線分析CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3以及CTLA-4陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)急性腦梗死患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料的比較結(jié)果見(jiàn)表1，兩組年齡、性別、既往病史、血清LDL-C、HDL-C、膽固醇與甘油三酯水平等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組一般臨床資料的比較

2.2 兩組外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)表2。與健康對(duì)照組比較，急性腦梗死組CD8+T細(xì)胞中PD-1和CTLA-4陽(yáng)性率下降。

表2 兩組外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3和CTLA-4陽(yáng)性率的比較 %

2.3 急性腦梗死患者不同預(yù)后組臨床參數(shù)比較根據(jù)急性腦梗死患者mRS評(píng)分，預(yù)后好43例，預(yù)后差65例。預(yù)后好組CD8+T細(xì)胞中PD-1陽(yáng)性率高于預(yù)后差組。急性腦梗死患者不同預(yù)后組臨床參數(shù)比較見(jiàn)表3。

2.4 急性腦梗死預(yù)后影響因素的Logistic回歸分析以患者CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽(yáng)性率，性別(女=0，男=1)，年齡，吸煙史、糖尿病病史、高血壓病史(無(wú)=0，有=1)為自變量，以急性腦梗死預(yù)后為因變量(預(yù)后好為1，預(yù)后差為0)，進(jìn)行Logistic回歸，結(jié)果顯示患者CD8+T細(xì)胞中PD-1陽(yáng)性率是急性腦梗死預(yù)后的影響因素，PD-1陽(yáng)性率越高，患者預(yù)后越好(表4)。

表4 急性腦梗死預(yù)后影響因素的logistic分析

2.5 急性腦梗死患者CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值結(jié)果見(jiàn)圖1及表5。CD8+T細(xì)胞中PD-1陽(yáng)性率預(yù)測(cè)患者較好預(yù)后的ROC曲線下面積為0.888(95%CI為0.825～0.951)；PD-1陽(yáng)性率為13.65%時(shí)，敏感度為88.4%，特異度為80.0%。

圖1 急性腦梗死患者CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽(yáng)性表達(dá)率預(yù)測(cè)預(yù)后的ROC曲線

表5 CD8+T細(xì)胞中PD-1、Tim-3、CTLA-4陽(yáng)性率對(duì)急性腦梗死預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

3 討論

在腦梗死發(fā)生24 h后，適應(yīng)性免疫反應(yīng)就已經(jīng)開(kāi)始激活[10]。目前普遍認(rèn)為T(mén)細(xì)胞在腦梗死急性期起促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重神經(jīng)損傷的作用[2]。淋巴細(xì)胞重組研究[11]結(jié)果顯示，在腦梗死后的血栓形成以及炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的為CD8+T細(xì)胞。CD8+T細(xì)胞作為細(xì)胞毒性T細(xì)胞主要識(shí)別MHC Ⅰ類分子相關(guān)抗原。CD8+T細(xì)胞被激活后通過(guò)脫顆粒反應(yīng)將蛋白顆粒酶、類似于補(bǔ)體C9功能的穿孔素、蛋白聚糖絲氨酸釋放至細(xì)胞間質(zhì)。穿孔素可以導(dǎo)致細(xì)胞穿孔，而顆粒酶可以激活凋亡途徑，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷[12]。本研究結(jié)果顯示急性腦梗死發(fā)生后CD8+T細(xì)胞中起免疫抑制功能的PD-1的表達(dá)下調(diào)，這可能與腦梗死早期CD8+T被大量激活并且主要發(fā)揮炎癥促進(jìn)作用有關(guān)。既往一些研究[13-14]結(jié)果顯示，與健康人相比，急性腦梗死患者外周血CD8+T細(xì)胞中Tim-3陽(yáng)性表達(dá)率沒(méi)有變化。我們的結(jié)果與上述研究一致。Zhao等[14]的研究結(jié)果顯示，急性腦梗死后Tim-3在CD4+T細(xì)胞與CD14+的單核細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)。因此，我們推測(cè)急性腦梗死后免疫檢查點(diǎn)分子CTLA-4與Tim-3主要通過(guò)其他類型的免疫細(xì)胞發(fā)作免疫抑制作用。急性腦梗死患者PBMC上CTLA-4的表達(dá)率沒(méi)有變化[15]。而蔣福生等[16]發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死后CTLA-4在CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果顯示急性腦梗死組CD8+T細(xì)胞中CTLA-4陽(yáng)性率下降。

PD-1是表達(dá)于T細(xì)胞表面的一種抑制性受體。PD-1通過(guò)與它的兩種配體PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-CD)相互作用發(fā)揮抑制T細(xì)胞活化、增殖和細(xì)胞因子分泌的作用[17]。在小鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)缺血模型中，PD-1途徑的激活可以限制梗死體積，減少炎癥細(xì)胞從外周招募至缺血組織，減少巨噬細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞的激活最終降低小鼠神經(jīng)功能損傷[18]。同時(shí)缺少PD-1配體(PD-L1與PD-L2)也可導(dǎo)致小鼠MCAO模型梗死面積增大，并且 PD-L1參與抑制炎癥細(xì)胞向梗死灶浸潤(rùn)、減少T細(xì)胞與單核細(xì)胞激活以及抑制后續(xù)的炎癥反應(yīng)，不僅如此 PD-L1還介導(dǎo)了腦梗死后T細(xì)胞上PD-1表達(dá)的上調(diào)[19]。對(duì)34例急性腦梗死患者以及25例正常人外周血進(jìn)行RNA芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死發(fā)生24至48 h之后，患者外周血CLTA-4信號(hào)途徑顯著上調(diào)[20]。阿托伐他汀能通過(guò)上調(diào)CTLA-4陽(yáng)性的CD4+CD25+細(xì)胞的比例來(lái)降低MCAO模型大鼠的梗死面積以及神經(jīng)功能損傷[21]。Tim-3在腦梗死患者外周血中的表達(dá)上調(diào)，并且CD4+T細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)與IL-17的表達(dá)相關(guān)，CD14+單核細(xì)胞上Tim-3的表達(dá)與TNF-α相關(guān)，因此Tim-3可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)在急性腦梗的病理過(guò)程中起重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，PD-1在預(yù)后較好患者中的陽(yáng)性率更高，并且是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，與上述結(jié)果一致。本研究結(jié)果提示，雖然與健康人相比，急性腦梗死患者外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)下降，但是其功能仍然應(yīng)該為抑制急性腦梗后炎癥反應(yīng)與促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)急性腦梗死后，患者外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)較健康人降低;外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1表達(dá)率可以較好預(yù)測(cè)急性腦梗死的預(yù)后，PD-1表達(dá)率越高，預(yù)后越好?？傊覀兊难芯拷Y(jié)果提示患者外周血CD8+T細(xì)胞中PD-1可能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。