萬成穎，余文穎，孔令義（通訊作者）

（中國藥科大學<江蘇省天然產(chǎn)物研究重點實驗室，天然藥物國家重點實驗室> 江蘇 南京 210009）

吳茱萸堿是從蕓香科植物吳茱萸的果實中分離得到的一種喹唑啉類生物堿，具有抗炎，抗腫瘤等廣泛的生物學活性[1]。隨著近年來吳茱萸堿的抗腫瘤機制的深入研究，發(fā)現(xiàn)其可通過與拓撲異構(gòu)酶（topoisomerase,Topo）活性位點結(jié)合抑制Topo 活性，從而誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖和遷移[2]。組蛋白去乙?；福℉DAC）是一類表觀遺傳酶，能調(diào)節(jié)多種組蛋白和非組蛋白的乙?；刂苹虻霓D(zhuǎn)錄，參與細胞增殖、遷移、死亡和血管生成[3]。HDAC 在癌細胞中高表達，被認為是癌癥治療的重要分子靶點[4]。HDAC 與許多癌基因和腫瘤抑制因子相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1 和HDAC2 與Topo 高度相關(guān)，2 種酶之間存在一個功能耦合的復合物，能在體內(nèi)相互作用[5]。近年來，HDAC 和Topo 的雙靶點抑制劑受到廣泛關(guān)注，HDAC 抑制劑與Topo 抑制劑的協(xié)同作用有望減少腫瘤耐藥性，顯示出更強的抗腫瘤活性[6]。本研究報道了一類基于HDAC 特異性抑制劑伏立諾他（suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA）和拓撲異構(gòu)酶抑制劑吳茱萸堿的雙重抑制劑，并對其抗腫瘤活性進行了探討，報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

所有溶劑和試劑均購自商業(yè)供應(yīng)商，無需進一步純化即可使用。硅膠GF254 板，100-200 目硅膠（青島海洋化工）；ACF-500 MHz 型磁共振儀（美國Bruker 公司）；Melting Point B545 熔點儀（瑞士BUCHI 公司）；安捷倫HP1100 型質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）。BD Accuri C6流式細胞儀（美國碧迪公司）。實驗所用細胞株購于美國菌種保藏中心。

1.2 方法

（1）合成方法：中間化合物1 ～4 的合成。取吳茱萸堿（3.0 g，1 mmol）溶解于二甲基甲酰胺溶液（15 mL）中，加入鈉氫（0.35 g，1.5 mmol），室溫攪拌反應(yīng)10 min后加入5-溴戊酸甲酯（1.92 g，1 mmol），緩慢升溫至80℃，再反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后加水（30 mL）淬滅。用乙酸乙酯萃取，合并有機層。采用柱層析法分離純化，得 到5-（14- 甲 基-5- 氧 代-7,8,13b，14- 四 氫 吲 哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）戊酸甲酯，為中間化合物1。同法制備得到6-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）己酸酯（中間化合物2）、7-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）庚酸甲酯（中間化合物3）、8-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚甲基[2'，3'：3,4]吡啶基[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）辛酸甲酯（中間化合物4）。

目標化合物Ev4C-Ev7C 的合成。取鹽酸羥胺（4.67 g，67 mmol）溶解在甲醇溶液（25 mL）中，在冰浴攪拌下滴加含有氫氧化鉀（5.61 g，100 mmol）的甲醇溶液（12 mL），在冰浴中反應(yīng)30 min。過濾沉淀物，得到濾液，為羥胺甲醇溶液。然后，將化合物1（0.048 g，0.11 mmol）溶解在上述新制備的羥胺甲醇溶液（15 mL）中。在室溫下攪拌反應(yīng)45 min，然后用乙酸調(diào)節(jié)至pH7。將混合物濃縮，殘留物用水洗滌，得到N-羥基-5-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2’，3’：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）戊酰胺，命名為Ev4C。同法制備得到化合物N-羥基-6-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2'，3'：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）己酰胺（Ev5C）、N-羥基-7-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2’，3’：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）庚酰胺（Ev6C）和N-羥基-8-（14-甲基-5-氧代-7,8,13b，14-四氫吲哚并[2’，3’：3,4]吡啶[2,1-b]喹唑啉-13（5 H）-基）己酰胺（Ev7C），均為黃色固體。

（2）細胞增殖抑制率檢測：將細胞以5×103/孔的密度接種在96 孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至貼壁。加入測試化合物孵育24 h 后，向每個孔中加入含3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（3-（4,5-dimethyl-2-thiazolyl）-2,5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide, MTT）的培養(yǎng)基，再孵育4 h。棄去MTT，加入二甲基亞砜混勻。使用酶標儀檢測各孔的吸光值，通過Logit法測定引起50%細胞生長抑制的濃度。所有實驗進行3 次。

（3）細胞凋亡分析：將HT29細胞以5×105/孔的密度接種在6 孔板中，用濃度為5μM 的化合物處理24 h或48 h。然后消化收集細胞，用磷酸緩沖溶液洗滌2 次后離心除去上清液，按照Annexin-V-FITC 凋亡試劑盒進行染色，后用流式細胞儀進行分析。所有實驗進行3 次。

（4）細胞內(nèi)活性氧水平分析：將HT29 細胞以5×105/孔的密度接種在6 孔板中，用不同濃度的化合物處理24 h。然后消化收集細胞，用磷酸緩沖溶液洗滌2 次后離心除去上清液，之后按照活性氧檢測試劑盒步驟進行處理。采用流式細胞儀檢測熒光（λEx=488 nm,λEm=525 nm）。所有實驗進行3 次。

2.結(jié)果

2.1 MTT 法測定細胞增殖抑制率

4 個目標化合物對人結(jié)腸癌細胞HT29、人乳腺癌細胞MCF-7 2 種癌細胞系呈現(xiàn)中等至良好的抑制作用，而對人正常結(jié)腸細胞NCM-460 的抑制作用偏弱。此外，Ev6C 顯示出最優(yōu)的抗腫瘤活性，比SAHA 和吳茱萸堿活性更高，且提高了安全性，顯示出雙靶點抑制劑的優(yōu)越性。此外，亞甲基鏈的長度的增加導致細胞毒性的提高，這可能與抗HDAC 活性相關(guān)[7]，見表1。

表1 化合物Ev4C-Ev7C 細胞毒活性檢測

2.2 細胞凋亡分析

接著我們進行了凋亡檢測，進一步評估目標化合物的抗腫瘤機制。結(jié)果顯示，化合物Ev6C 在HT29 細胞系中呈現(xiàn)出強烈的促凋亡活性，孵育24 h 和48 h 后細胞總凋亡率分別為25.04%和57.30%（Annexin Ⅴ+-PI-和Annexin Ⅴ+-PI+象限的細胞總數(shù)），凋亡水平明顯高于SAHA（21.34%和34.80%）和吳茱萸堿（16.01%和46.40%），說明化合物Ev6C 通過抑制拓撲異構(gòu)酶和HDAC在細胞水平上發(fā)揮協(xié)同作用。

2.3 細胞內(nèi)活性氧水平分析

越來越多的證據(jù)表明，過量的活性氧水平與腫瘤細胞凋亡有關(guān)[8]。隨后，我們評估了Ev6C 對HT29 細胞中活性氧產(chǎn)生的影響。結(jié)果顯示，Ev6C 孵育后，HT29 細胞的活性氧水平顯著增加，分別在2、2.5 和10μM 時增加1.58、2.59、5.25 倍。Ev6C 劑量依賴性刺激活性氧的表達。

3.討論

作為吳茱萸的有效成分，吳茱萸堿對多種癌細胞具有顯著的抗增殖作用，是優(yōu)選的先導化合物[9]?；谕負洚悩?gòu)酶和HDAC 之間的潛在生物聯(lián)系，拓撲異構(gòu)酶和HDAC 抑制劑能發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用[10]。我們合理地設(shè)計并合成了一系列吳茱萸堿衍生物。值得注意的是，化合物Ev6C 作為Topo/HDAC 的有效抑制劑，顯示出良好的抗增殖活性和安全性。進一步分析了化合物Ev6C 誘導腫瘤細胞凋亡和誘導活性氧產(chǎn)生的情況，結(jié)果顯示癌細胞呈現(xiàn)顯著的凋亡效應(yīng)，且活性氧水平顯著提高，并呈劑量依賴性增加。兩者顯示化合物Ev6C 抗腫瘤機制之一是誘導細胞凋亡。

綜上所述，相比單個拓撲異構(gòu)酶或HDAC 抑制劑，化合物Ev6C 具有更好的抗腫瘤活性，具有近一步的研究價值。