張珂，肖瑞霞，修賀明

(河南金泰生物技術(shù)股份有限公司，河南 鄭州 450000)

葉酸參與體內(nèi)多種生化反應(yīng)，對(duì)維持染色體穩(wěn)定起著重要作用[1]。葉酸本身無(wú)活性，需要5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)與甲硫氨酸合成酶還原酶(methionine synthase reductase，MTRR)的參與才能發(fā)揮活性并維持體內(nèi)葉酸的正常代謝[2]。MTHFR和MTRR突變后酶活性降低，導(dǎo)致體內(nèi)同型半胱氨酸水平升高及DNA低甲基化，從而引起多種疾病。葉酸缺乏是新生兒神經(jīng)缺陷發(fā)生的主要病因，育齡婦女適當(dāng)補(bǔ)充葉酸可有效預(yù)防新生兒出生缺陷的發(fā)生[3-5]。本研究對(duì)河南地區(qū)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性進(jìn)行分析，為個(gè)體化增補(bǔ)葉酸及降低疾病發(fā)生率提供遺傳學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象根據(jù)知情同意的原則，對(duì)河南地區(qū)受檢人群進(jìn)行遺傳檢測(cè)，排除DNA抽提不符合要求者，共獲取有效樣本數(shù)量344例，其中男173例，女171例。

1.2 DNA采集與基因分型采集受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞，利用柱式抽提試劑盒進(jìn)行DNA抽提，抽提試劑盒采購(gòu)于上海生工。采用AGENA公司Mass ARRAY?DNA質(zhì)譜陣列基因分析系統(tǒng)進(jìn)行MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因多態(tài)性的檢測(cè)。通過(guò)ASSAY DESIGN SUITE V2.0進(jìn)行在線引物設(shè)計(jì)，引物信息見(jiàn)表1。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)反應(yīng)分為3步(多重PCR反應(yīng)，SAP反應(yīng)，iPLEX延伸反應(yīng))進(jìn)行，檢測(cè)試劑盒為Complete iPLEX?Gold Genotyping Reagent Set 10X96。多重PCR反應(yīng)：95 °C預(yù)變性2 min，45個(gè)循環(huán)(95 °C 30 s，56 °C 30 s，72 °C 1 min)，72 °C延伸5 min。SAP反應(yīng)：37 °C 40 min，85 °C 5 min，4 °C 2 min。iPLEX反應(yīng)：94 °C 30 s，40個(gè)循環(huán)(94 °C 5 s)，5個(gè)循環(huán)(52 °C 5 s，80° C 5 s)，72 °C 5 min。反應(yīng)體系見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)結(jié)束后，利用分析軟件確定各個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。

表1 引物序列信息

表2 PCR反應(yīng)條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)基因分型頻數(shù)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行基因頻數(shù)和等位基因頻率的統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡分析本研究共有受檢者344例，其中男173例，女171例。MTHFRC677T位點(diǎn)檢出3種基因型：野生型CC、雜合突變型CT、純合突變型TT；MTHFRA1298C位點(diǎn)檢出3種基因型：野生型AA、雜合突變型AC、純合突變型CC；MTRRA66G位點(diǎn)檢出3種基因型：野生型AA、雜合突變型AG、純合突變型GG。MTHFRC677T、A1298C和MTRRA66G基因位點(diǎn)基因型實(shí)際頻數(shù)與理論頻數(shù)吻合度良好，Hardy-Weinberg遺傳平衡結(jié)果證明基因多態(tài)性分布符合遺傳平衡法則(P>0.05)，樣本具有區(qū)域樣本代表性。見(jiàn)表3。

2.2MTHFR和MTRR基因頻數(shù)和等位基因頻率MTHFRC677T基因位點(diǎn)野生型CC 85例(24.71%)，雜合突變型CT 162例(47.09%)，純合突變型TT 97例(28.20%)，C677T位點(diǎn)C等位基因頻率為48.26%，T等位基因頻率為51.74%。MTHFRA1298C基因位點(diǎn)野生型AA 242例(70.35%)，雜合突變型AC 89例(25.87%)，純合突變型CC 13例(3.78%)，A1298C位點(diǎn)A等位基因頻率為83.28%，C等位基因頻率為16.72%。MTRRA66G基因野生型AA 191例(55.52%)，雜合突變型AG 131例(38.08%)，純合突變型GG 22例(6.40%)，A66G位點(diǎn)A等位基因頻率為74.56%，G等位基因頻率為25.44%。男女受檢者M(jìn)THFRC677T、A1298C和MTRRA66G的基因型頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4。

表3 河南地區(qū)葉酸代謝MTHFR及MTRR基因位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

表4 MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G位點(diǎn)基因型頻率[n(%)]

2.3 河南地區(qū)女性MTHFR、MTRR等位基因頻數(shù)和頻率與其他地區(qū)的比較

2.3.1MTHFRC677T 河南地區(qū)女性MTHFRC677T等位基因和基因型頻率分布情況與武漢[6]、瓊海[7]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.136、129.891，P<0.001)；其分布情況與尚志[8]、煙臺(tái)[9]、太原[10]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.182、3.064、0.802，P=0.204、0.216、0.670)。見(jiàn)表5。

表5 不同地區(qū)女性MTHFR C677T基因型頻數(shù)和頻率比較[n(%)]

2.3.2MTHFRA1298C 河南地區(qū)女性MTHFRA1298C等位基因和基因型頻率分布情況與瓊海[7]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.854，P=0.003)；其分布情況與武漢[6]、尚志[8]、煙臺(tái)[9]、太原[10]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.970、1.500、2.393、2.379，P=0.616、0.472、0.302、0.304)。見(jiàn)表6。

表6 不同地區(qū)女性MTHFR A1298C基因型頻數(shù)和頻率比較[n(%)]

2.3.3MTRRA66G 河南地區(qū)女性MTRRA66G等位基因和基因型頻率分布情況與武漢[6]、瓊海[7]、尚志[8]、煙臺(tái)[9]、太原[10]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.083、0.705、0.339、5.412、1.665，P=0.959、0.703、0.844、0.067、0.435)。見(jiàn)表7。

表7 不同地區(qū)女性MTRR A66G基因型頻數(shù)和頻率比較[n(%)]

3 討論

MTHFR、MTRR是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶。MTHFR基因在葉酸代謝通路中將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)功能的5-甲基四氫葉酸。MTRR能夠通過(guò)還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。兩者使血液中的同型半胱氨酸保持在一個(gè)較低的水平。同型半胱氨酸的蓄積可增加各種心血管疾病的發(fā)生，損害和干擾心血管生長(zhǎng)發(fā)育。近年研究也驗(yàn)證了高同型半胱氨酸血癥與阿爾茨海默病相關(guān)[11-12]。在制定葉酸補(bǔ)充方案時(shí)，需要考慮遺傳因素，做到個(gè)性化補(bǔ)充。

MTHFRC677T基因多態(tài)性突變位點(diǎn)位于MTHFR的第4外顯子，該突變導(dǎo)致纈氨酸向222密碼子丙氨酸轉(zhuǎn)化，這是一種降低酶活性的常見(jiàn)多態(tài)性。MTHFR677 CT型酶活性可下降30%～40%，而純合突變型TT個(gè)體酶活性下降60%～70%[13]。本研究結(jié)果顯示，MTHFRC677T基因位點(diǎn)T等位基因頻率為51.74%，CT、TT基因型頻率為47.09%、28.20%。這與中國(guó)人群中約29%的MTHFR677TT基因型結(jié)果保持一致[14-15]。女性MTHFRC677T位點(diǎn)基因型與武漢[6]、瓊海[7]不一致。這表明MTHFRC677T多態(tài)性分布具有明顯的地域特征。

A1298C是MTHFR基因的另一個(gè)主要變異位點(diǎn)，其突變使氨基酸序列中的谷氨酸被丙氨酸代替，導(dǎo)致MTHFR酶活性降低。MTHFRC677T、A1298C兩處的突變存在協(xié)同作用，雙突變后酶活性僅為野生型的15%左右[6,16]。本研究結(jié)果顯示，河南人群中1298AC基因型頻率25.87%，純合突變型CC 3.78%，1298CC基因型頻率3.78%，C等位基因頻率為16.72%。但研究發(fā)現(xiàn)單一MTHFRA1298C基因突變位點(diǎn)與新生兒神經(jīng)管畸形、新生兒先天性心臟病、高同型半胱氨酸血癥等發(fā)生并無(wú)明顯相關(guān)性[17-19]。MTRRA66G突變可導(dǎo)致第22位的氨基酸發(fā)生變化，原有的異亮氨酸被甲硫氨酸取代，酶活性降低，增加神經(jīng)管畸形等出生缺陷的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中，河南地區(qū)MTHFR和MTRR基因多態(tài)性分布不受性別影響，且多數(shù)人群存在葉酸代謝障礙、葉酸利用能力不足等情況。對(duì)于一般人群，補(bǔ)充葉酸的有效且安全劑量為每日0.4～1.0 mg[11,20-21]。建議無(wú)高危因素的育齡婦女每日增補(bǔ)葉酸0.4 mg或0.8 mg，直至妊娠滿3個(gè)月。MTHFR677位點(diǎn)TT基因型婦女可根據(jù)個(gè)體情況酌情增加葉酸補(bǔ)充劑量或延長(zhǎng)孕前增補(bǔ)時(shí)間。推薦合并高同型半胱氨酸血癥的心血管疾病高危人群和高血壓患者每日服用0.8 mg葉酸或聯(lián)合服用維生素B12以達(dá)到最佳的降低同型半胱氨酸水平的效果。需注意長(zhǎng)期大劑量補(bǔ)充葉酸(包括葉酸強(qiáng)化食物)有可能產(chǎn)生健康風(fēng)險(xiǎn)，如增加某些癌癥(結(jié)直腸癌和前列腺癌等)風(fēng)險(xiǎn)，掩蓋維生素B12缺乏的早期表現(xiàn)，加重神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，與其他藥物相互干擾影響鋅吸收或降低葉酸吸收率，降低免疫力，增加?jì)D女妊娠高血壓和妊娠糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)等[21-24]。

綜上所述，針對(duì)葉酸代謝障礙、育齡婦女等特殊人群，開(kāi)展基因檢測(cè)了解相關(guān)基因的多態(tài)性并評(píng)估葉酸代謝能力對(duì)幫助臨床醫(yī)生制定個(gè)體化葉酸補(bǔ)充方案有重要意義。