周瑩宇 付雷 張煒焱 王彬 陳曦 陸宇 陳效友

目前，耐藥結核病形勢依然嚴峻[1]。結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)在獲得耐藥性的同時，也需要不斷進化其菌株毒力和適應性[2-3]，使其菌體能夠逃避和適應巨噬細胞內惡劣的酸性環(huán)境、抑制吞噬體融合、躲避活性氧或者活性氮中間產(chǎn)物的殺傷作用[4]，以達到在免疫力低下患者體內長期潛伏，甚至發(fā)展成為持留狀態(tài)的目的[5]。這些改變可由其自身的耐藥基因引起，也可由其他的突變造成[6-7]。

近年來，隨著抗結核新藥廣泛且長期的應用，對利奈唑胺(linezolid，Lzd)、pretomanid(PA-824)、氯法齊明 (clofazimine，Cfz)、貝達喹啉(bedaquline，Bdq)耐藥的菌株已時有報道[8]。對這些耐藥菌株毒力的研究，可以更好地了解耐藥過程中菌體的適應性、毒力變化及對機體致病能力的強弱，為菌株毒力改變的機制研究提供依據(jù)。筆者通過小鼠生存實驗繪制臨床耐藥分離株及實驗室誘導耐藥菌株生長曲線，測定巨噬細胞內MTB菌落形成單位(colony-forming units，CFU)計數(shù)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)的釋放量及其在小鼠體內的毒力變化情況，以評價不同耐藥類型MTB菌株的毒力變化與耐藥種類及數(shù)量的關系。

材料和方法

一、實驗菌株、細胞及動物

選取MTB標準株H37Rv(ATCC27294，1株)、減毒株H37Ra(ATCC25177，1株)、單耐Lzd菌株(L1，1株)、單耐PA-824菌株(P1，1株)、單耐PBTZ-169(macozinone，MCZ)菌株(169-1、169-2、169-3，各1株)、耐LPDR菌株(同時耐Lzd 和PA-824，分別為PL1、PL2、PL3，各1株)、耐多藥(multidrug-resistant，MDR)菌株(15833和16030，各1株)、準廣泛耐藥(pre-extensive drug resis-tance，pre-XDR)菌株(17080和30744，各1株)，共計14株作為實驗菌株。所有菌株均為北京市結核病胸部腫瘤研究所藥物學研究室保存菌株；其中15833、16030、17080和30744菌株為臨床分離耐藥株，單耐Lzd、單耐PA-824、單耐PBTZ-169和耐LPDR菌株為實驗室誘導耐藥株(來源于H37Rv)。單核鼠源巨噬細胞(J774A.1)購自北京協(xié)和細胞資源中心。BALB/c小鼠(168只，6～7周齡，體質量16～18 g/只；分為14組，每組12只)均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

二、實驗藥品

利福平(rifampin，RFP；批號：014M2578V)、異煙肼(isoniazid，INH；批號：MKcl5638)、乙胺丁醇(ethambutol，EMB；批號0000086360)、鏈霉素(streptomycin，Sm；批號000083719)、莫西沙星(moxifloxacin，Mfx；批號：BCB23918)、左氧氟沙星(levofloxacin，Lfx；批號：089M4779v)；PA-824(批號20190528)、Lzd(批號AOX137)購于美國Ark Pharm公司。PBTZ-169為全球結核病藥物研發(fā)聯(lián)盟惠贈。

三、主要試劑和儀器

1.試劑：Middle brook 7H9培養(yǎng)基(批號：8341764)、7H10培養(yǎng)基(批號：9148924)、OADC增菌液(批號：92006278)均購自美國BD公司；RPMI細胞培養(yǎng)液(批號：AD21582265)購自美國GE公司；胎牛血清(批號：42F1476K)購自美國Gibco公司。

2.儀器：多功能酶標儀(型號：Infinite M200pro，瑞士迪肯公司)，電熱水浴鍋(型號：WBK-3B，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)。

四、研究方法

1. 最低抑菌濃度(MIC)檢測：采用微孔板阿爾瑪藍顯色法(microplate Alamar blue assay，MABA)。10%二甲基亞砜(DMSO)配置藥物儲備液，使用前稀釋至所需濃度。設置陰性對照孔和陽性對照孔，將藥物在96微孔熒光板進行二倍稀釋至相應濃度后，每孔加入100 μl菌液和100 μl 7H9培養(yǎng)基。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱7 d，向各孔加入20 μl阿爾瑪藍和12.5 μl吐溫-80(利于菌液懸浮)，37 ℃孵育24 h，用酶標儀測定各孔的吸光度值(A590值)，并計算藥物對菌株的MIC值。

2.MTB菌株生長曲線的繪制：該實驗通過測量菌株體外繁殖能力，來反映菌株對體外環(huán)境的適應性。將菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時菌原液濃度適中，使用酶標儀測量其濃度的A570值(0.1=1×107CFU/ml)。根據(jù)濃度與體積公式(終濃度×20 ml/原菌液濃度)取一定體積的原菌液接種于20 ml 新配置的7H9液體培養(yǎng)基中并加入2 ml甘油混勻，使最終新培養(yǎng)基測得的A570值為0.01(即終濃度為1×106CFU/ml)，同時使用搖床使菌液分散混勻。再取100 μl的7H9液體培養(yǎng)基接種至7H10固體培養(yǎng)基中，為實際感染菌量。選取第0、3、7、14、21、28天時菌液倍比稀釋接種至7H10固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 5% CO2恒溫箱培養(yǎng)，3周后進行CFU計數(shù)，將實驗結果取對數(shù)，使用GraphPad Prism 8.0 繪制菌株28 d時的生長曲線[8]。

3.巨噬細胞內MTB的CFU計數(shù)[9]：該實驗通過測量菌株胞內繁殖能力，反映菌株在胞內的生存適應性。選取生長狀態(tài)良好的J774A.1巨噬細胞，將其消化后收集至離心管內，巨噬細胞稀釋濃度為4×105個/ml，以每孔1 ml將其鋪于48孔透明微孔板內，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。按照巨噬細胞與MTB濃度比值(MOI)為1∶1作為最佳濃度(即菌液濃度4×105CFU/ml)，將MTB與巨噬細胞置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)，4 h后使用無菌磷酸鹽(PBS)清洗2次，去除胞外MTB，再加入新的RPMI細胞培養(yǎng)基，重新置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2 d后將細胞裂解，每孔取100 μl進行倍比稀釋。取50 μl接種于7H10固體培養(yǎng)基上，3周后進行CFU計數(shù)。

根據(jù)預實驗結果發(fā)現(xiàn)，當MOI為1∶1時，培養(yǎng)2 d的巨噬細胞生長狀態(tài)最佳，細胞損傷程度較小，LDH的釋放程度也較低。而隨著菌液密度的增大或培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞生長狀態(tài)不穩(wěn)定現(xiàn)象逐步增加，甚至出現(xiàn)細胞營養(yǎng)不良、貼壁不牢固而加大細胞損失的情況，同時LDH的釋放程度也逐漸升高。

4. 巨噬細胞LDH釋放程度測定[10]：該實驗通過測定巨噬細胞的損傷程度，反映菌株對巨噬細胞的毒力程度。將巨噬細胞濃度稀釋為4×105/ml，鋪于96孔透明微孔板內，設置陰性對照孔和陽性對照孔(添加10 μl細胞裂解液)。將各耐藥菌株濃度稀釋為4×105CFU/ml(MOI=1∶1)，鋪于實驗孔和陽性對照孔，共孵育4 h后使用PBS清洗2次，去除胞外MTB，再加入新的RPMI細胞培養(yǎng)基。置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 d。將上清液以50 μl/孔轉移至新的酶分析板中，添加底物50 μl/孔。室溫避光孵育30 min后于每孔加入50 μl終止液，在波長490 nm處檢測其吸光度值(A490值)，以及實驗組(含菌液孔)與巨噬細胞最大釋放組(陽性對照孔)吸光度值的比值，并以此為測量結果。

5.小鼠生存期測定：小鼠生存曲線為菌株毒力判斷最重要的指標。將各耐藥菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用酶標儀測量其吸光度值(A570值)，并使用無菌生理鹽水將菌液濃度配制成1×108CFU/ml。使用搖床將菌液混勻后，以尾靜脈注射的方式感染BALB/c小鼠，每只小鼠注射菌量為0.2 ml(1×108CFU/ml，5×107CFU/只)；同時將各菌株倍比稀釋后接種于7H10固體培養(yǎng)基，3周后進行CFU計數(shù)(以驗證小鼠初始感染菌量)。觀察8周，記錄小鼠死亡情況。小鼠實際初始感染菌量依據(jù)文獻[11-12]選擇1×107CFU/ml～1×108CFU/ml，此濃度下每組小鼠生存期差異明顯，劑量選取可行。

注 以H37Rv標準株、H37Ra減毒株作為對照 注 以H37Rv標準株、H37Ra減毒株作為對照圖4 小鼠感染結核分枝桿菌臨床耐藥分離株后的生存曲線 圖5 小鼠感染結核分枝桿菌實驗室誘導耐藥株后的生存曲線

注 INH：異煙肼；RFP：利福平；EMB：乙胺丁醇；Sm：鏈霉素；Lfx：左氧氟沙星；Km：卡那霉素；PA-824：pretomanid；Lzd：利奈唑胺；PBTZ-169：macozinone圖6 不同耐藥菌株毒力強弱與耐藥品數(shù)量的關系

五、統(tǒng)計學處理

結 果

一、菌株表型耐藥情況

標準株H37Rv和臨床分離株耐藥類型及MIC值見表1。實驗誘導耐藥菌株對Lzd、PA-824或PBTZ-169藥品耐藥類型及MIC值見表2。結果顯示，不同耐藥菌株的毒力均較標準菌株有所下降，且15833、16030、17080、30744耐藥種類分別為2種、3種、5種、5種(表1、2)。

表1 結核分枝桿菌H37Rv標準株和臨床分離耐藥株對各藥品的MIC值(μg/ml)

表2 結核分枝桿菌H37Rv標準株、H37Ra減毒株和實驗室誘導耐藥株對各藥品的MIC值

二、MTB體外生長曲線

MTB體外第0天實際菌量計數(shù)約為1×105CFU/ml，根據(jù)不同菌株在不同時間的胞內CFU計數(shù)結果和生長曲線觀察到，經(jīng)過28 d的培養(yǎng)，14株菌株體外生長趨勢一致，大部分在第7～14 d即進入平臺期。其中，減毒株H37Ra生長較緩慢，臨床分離株30744菌株體外生長繁殖能力最低，體外生存適應性最差，具體見表3，圖1～3。

圖1 結核分枝桿菌H37Rv標準株、H37Ra減毒株和耐藥臨床分離株體外生長曲線 圖2 結核分枝桿菌H37Rv標準株、H37Ra減毒株及對Lzd、PA-824和LPDR耐藥菌株生長曲線 圖3 結核分枝桿菌H37Rv標準株、H37Ra減毒株及對PBTZ-169耐藥菌株生長曲線

表3 不同研究菌株在不同時間的胞內CFU計數(shù)結果

三、MTB胞內繁殖能力和對巨噬細胞的毒性

巨噬細胞被MTB感染2 d后，臨床分離株和PL1、PL3、PL2的胞內CFU均低于H37Rv標準株，胞內繁殖能力均降低，差異均有統(tǒng)計學意義；H37Ra減毒株的胞內繁殖能力也明顯低于H37Rv標準株，見表4。同時，各類型菌株LDH的釋放量均明顯低于H37Rv標準株，其中，H37Ra感染組LDH釋放量最低，細胞損傷程度最低，見表5。

表4 不同類型結核分枝桿菌感染巨噬細胞2 d后胞內CFU計數(shù)情況

表5 不同類型結核分枝桿菌感染巨噬細胞2 d后巨噬細胞釋放乳酸脫氫酶情況

四、小鼠生存分析

1.小鼠半數(shù)生存期情況：各實驗菌株感染小鼠后分別觀察56 d。發(fā)現(xiàn)H37Rv標準株感染的小鼠半數(shù)生存期為12 d，第18天全部死亡；H37Ra減毒株感染后，直至實驗結束無小鼠死亡；其他耐藥株感染小鼠后，小鼠的半數(shù)生存時間見表6，使用Kaplan-Meier生存分析方法繪制小鼠生存曲線，見圖4，5。

表6 小鼠感染不同類型結核分枝桿菌后的存活狀態(tài)及半數(shù)生存期

2.小鼠生存曲線分析：觀察圖4發(fā)現(xiàn)，與H37Rv相比，所有臨床分離株組小鼠生存時間均延長，其中，Pre-XDR菌株感染小鼠的存活時間長于MDR菌株，以30744臨床分離株組小鼠存活時間最長；經(jīng)log-rank法分析各菌株間小鼠8周內生存期分布情況，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，見表7。

表7 H37Rv、H37Ra和臨床分離株感染的小鼠8周內生存期分布的log-rank法分析結果

觀察圖5發(fā)現(xiàn)，對于實驗室誘導耐藥菌株，單耐PA-824菌株P1感染小鼠后，小鼠的存活時間最短；而PL1、PL3菌株感染小鼠后，小鼠的存活時間長于其他實驗室誘導耐藥株，且PL1菌株感染小鼠后，直至實驗結束時未達到半數(shù)死亡，即雙重耐藥菌株LPDR組小鼠存活時間>PBTZ-169耐藥菌株組=單耐Lzd組>單耐PA-824耐藥菌株組。通過log-rank法分析各菌株間小鼠8周內生存期分布情況，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，見表8。

表8 H37Rv、H37Ra和實驗室誘導耐藥菌株感染的小鼠8周內生存期分布的log-rank法分析結果

五、菌株耐藥數(shù)量與其毒力大小的關系

通過12株耐藥菌對藥物的MIC結果和以上對菌株毒力的檢測結果，發(fā)現(xiàn)pre-XDR菌株(30744和17080)的毒力弱于MDR菌株(15833和16030)，雙重耐藥菌株LPDR的毒力<單耐PBTZ-169菌株=單耐Lzd<單耐PA-824菌株。呈現(xiàn)出隨著耐藥數(shù)量的增加菌株毒力下降程度更明顯的現(xiàn)象(圖6)。

討 論

MTB的毒力因子與感染宿主相互作用，可導致宿主相應組織出現(xiàn)病理性損傷。文獻報道，不同的MTB耐藥株可出現(xiàn)毒力的不同改變[3,13]，從而影響菌株的致病能力，如fadD26、fadD28、mas、mmpL7等毒力基因的改變會影響MTB鄰苯二甲酸硫菌酯(PDIM)的合成，降低菌株在巨噬細胞內的繁殖能力，對活性氧和活性氮中間產(chǎn)物的抵抗能力降低，從而降低菌株的致病能力[14]。也有研究認為，參與菌株氧化應激反應的轉錄調節(jié)因子sigma家族中sigF基因毒力位點的突變菌株也可引起小鼠脾肺的損傷[15]。而katGS315T位點的突變相較于其他katG基因位點，其適應性較高且毒力的改變較低，因此，該位點的突變在MDR-MTB菌株中廣泛存在[16-18]。另有文章分析了332株利福平耐藥菌株，其中rpoC基因補償突變占比最大，如在俄羅斯[19]、哈薩克斯坦[20]、非洲[21]的研究中大約90%的補償突變發(fā)生在rpoC基因中。因此，菌株毒力和適應性的改變可以影響菌株在人群中的流行。強毒株在巨噬細胞內可大量繁殖，極易在患者體內播散；而毒力和適應性減弱的菌株，其生存能力明顯降低，有利于用其進行毒力和致病因子的研究。故本研究選擇耐藥菌株以研究其毒力的變化情況，為耐藥菌株對機體的發(fā)病機制和耐藥結核病的防治提供依據(jù)，至于菌株毒力是否還受其他因素及位點改變的影響還需在后續(xù)實驗中進一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，大部分臨床耐藥分離株體外生存適應性與H37Rv標準株一致，但30744菌株體外生存適應性較差，其對Km的MIC值(22.03 μg/ml)明顯高于其他臨床株對Km的MIC值，但對Mfx和Lfx的MIC值(分別為0.03和0.18 μg/ml)明顯低于17080菌株(分別為0.61 μg/ml和3.34 μg/ml)。這提示30744菌株對注射類抗結核藥品的耐藥適應性要低于對氟喹諾酮類藥物。但考慮到單個菌株實驗的局限性，需進一步重復實驗加以驗證。

有研究認為，MTB產(chǎn)生耐藥的同時會造成其適應性的降低[22-23]，但本研究中大部分臨床耐藥分離株的適應性并無明顯降低，究其原因：(1)補償突變現(xiàn)象可使菌株適應性恢復正常，如INH發(fā)生katG突變耐藥的同時可伴隨ahpC基因的表達上調，從而使其適應性恢復[24]；但目前除對利福平的適應性代償研究較多外，對其他藥物耐藥的相關研究均較少，本研究仍傾向于可能存在補償性突變。(2)臨床耐藥分離株的適應性高低主要由其異位顯性作用決定[25]，即耐藥菌株適應性的改變不是由單一位點決定的，而是菌株耐藥和適應性相關位點及菌株背景信息綜合作用的結果[26]。因此，也可認為本研究選取的臨床耐藥分離株適應性并無明顯降低，可能是異位顯性作用的綜合結果。

研究顯示，臨床耐藥分離株胞內繁殖能力均低于標準菌株，說明其不能很好地耐受巨噬細胞內的酸性環(huán)境[27]，其對巨噬細胞的毒力降低。分析其原因可能有：(1)筆者選取的菌株均為INH耐藥菌株，在產(chǎn)生耐藥的同時也會影響過氧化物酶-過氧化氫酶途徑，導致其不能有效抵抗胞內的酸性環(huán)境，從而影響菌株抵抗氧或者活性氮的殺傷作用[28-29]。(2)MTB 可以通過分泌酸性磷酸酶，水解吞噬體膜上脂類蛋白PI3-P，抑制吞噬溶酶體的融合，抵抗殺傷作用。但對于實驗室誘導單耐Lzd、PA-824、PBTZ-169菌株的胞內繁殖能力除耐LPDR菌株明顯降低外，其他均與標準株相似，考慮與耐藥菌株相關基因突變有關，且突變基因的數(shù)量越多可能引起巨噬細胞內對抗上述機制的作用越弱，從而出現(xiàn)LPDR菌株較單一耐藥菌株胞內繁殖能力的下降。

巨噬細胞的破壞會釋放大量的LDH，該物質的吸光度值在490 nm處存在特異吸收峰，因此檢測反應體系中吸光度值的變化可以直接反映巨噬細胞死亡程度的高低[30]。本研究顯示，所有耐藥株感染巨噬細胞后LDH的釋放量均明顯低于H37Rv，提示耐藥株對巨噬細胞的破壞程度均較輕，對其細胞毒力均減弱。

小鼠半數(shù)生存期分析結果顯示，耐藥株感染小鼠后的生存時間均明顯長于H37Rv，這與文獻[14]報道一致；且感染30744和17080菌株的小鼠較感染15833和16030菌株的小鼠存活時間長，提示30744和17080菌株的毒力均較弱；而雙重耐藥LPDR菌株感染小鼠的存活時間>單耐PBTZ-169=單耐Lzd>單耐PA-824耐藥菌株，提示雙重耐藥菌株的毒力低于單耐藥菌株。另外，結合菌株MIC值和巨噬細胞實驗，結果顯示，耐藥數(shù)量越多的菌株，其感染小鼠后半數(shù)生存時間越長，也提示耐藥數(shù)量越多的菌株其毒力越弱。由此認為，菌株的耐藥數(shù)量可能與菌株的毒力呈負相關。但在對耐LPDR菌株的測定中發(fā)現(xiàn)，PL1和PL3組小鼠生存時間明顯長于PL2組，可能與誘導過程中PL1和PL3產(chǎn)生了對其他藥物的耐藥有關，但因本研究未對PL耐藥株進行對其他藥物的MIC檢測，尚不能完全確定相關性。

本研究通過細胞實驗及動物實驗僅初步評價了MTB臨床耐藥株、實驗誘導耐藥株相較于標準株的毒力變化情況，而對耐藥株毒力減弱的原因、突變形式，以及適應性的改變與菌株毒力大小的關系未進行深入探究。在未來的研究中，筆者認為可以通過菌株全基因組測序等生物學技術篩選出毒力相關耐藥突變位點，再通過敲除、回補或者過表達篩選基因，以觀察該位點對菌株毒力的影響。

綜上，筆者通過對MTB臨床耐藥分離株和耐Lzd、PA-824、LPDR及PBTZ-169菌株的生長繁殖能力、巨噬細胞的損傷程度，以及感染后小鼠生存時間的測定，初步了解了這些菌株的致病能力，發(fā)現(xiàn)相較于MTB標準株，抗結核新藥耐藥株的毒力均明顯下降，且其毒力的大小與耐藥的數(shù)量呈負相關。此結論可能為MTB耐藥株的發(fā)病機制研究和防治提供依據(jù)。