曹倩倩 祝秉東 牛紅霞

卡介苗(BCG)是唯一可用于臨床的結(jié)核病疫苗，但是其保護(hù)效果仍存在不確定性[1-2]。據(jù)報(bào)道，BCG可預(yù)防新生兒及兒童罹患結(jié)核性腦膜炎和粟粒性結(jié)核病等，但其對(duì)成人肺結(jié)核的保護(hù)效果欠佳[3]。全球結(jié)核病疫情仍然十分嚴(yán)峻[4]，迫切需要研發(fā)新型結(jié)核病疫苗。根據(jù)疫苗的組分或免疫策略，新型在研結(jié)核病疫苗分為結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗、重組BCG、病毒載體疫苗、結(jié)核分枝桿菌滅活疫苗和重組蛋白亞單位疫苗等類(lèi)型[5]。其中，重組蛋白亞單位疫苗基于結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性抗原蛋白及免疫佐劑構(gòu)建，其成分明確、安全性好，且可通過(guò)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較多的中央記憶性T細(xì)胞提供長(zhǎng)期免疫保護(hù)效果[6]。此外，重組蛋白亞單位疫苗還可作為治療性疫苗用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染的治療。筆者現(xiàn)將結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗的研究進(jìn)展綜述如下。

一、結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性抗原

應(yīng)用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組蛋白亞單位疫苗，首先需要篩選有效的結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性抗原。結(jié)核分枝桿菌菌體成分復(fù)雜，含有大量脂質(zhì)、多糖及近4000種蛋白質(zhì)，不同成分均具有一定的免疫原性。根據(jù)抗原的不同特性分為以下幾種類(lèi)型：

1.細(xì)胞壁及菌體表面抗原：結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁和莢膜含有大量的糖脂，如索狀因子、脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖、葡萄糖單霉菌酸酯、磷脂酰肌醇甘露糖苷等[7]。其中，索狀因子是分枝菌酸與海藻糖結(jié)合所形成的一種糖脂，可以刺激巨噬細(xì)胞釋放促炎因子，提高機(jī)體體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答；脂阿拉伯甘露聚糖、脂甘露聚糖與葡萄糖單霉菌酸酯可激活T細(xì)胞免疫應(yīng)答，降低細(xì)菌載量[8-9]。由此可見(jiàn)，結(jié)核分枝桿菌的這些糖脂組分可作為結(jié)核病疫苗候選抗原或佐劑。但是，糖脂抗原難以用生物工程的方法進(jìn)行制備，且分離純化單一組分困難，其在疫苗中的應(yīng)用還需更多探索。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁和莢膜的脂蛋白和糖蛋白同樣具有免疫原性，也可作為疫苗的候選抗原[10-11]。肝素結(jié)合血凝素是菌體表面黏附素，幫助結(jié)核分枝桿菌黏附在宿主細(xì)胞表面，促進(jìn)肺外感染的發(fā)生[12]。肝素結(jié)合血凝素不但能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生血清抗體和呼吸道黏膜抗體，還能夠激活Th1和Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答[13]。結(jié)核分枝桿菌菌毛蛋白能夠與宿主細(xì)胞層粘連蛋白結(jié)合，在激活黏膜免疫應(yīng)答方面強(qiáng)于分泌性蛋白。因此，結(jié)核分枝桿菌菌體表面的這些脂蛋白和糖蛋白在重組蛋白亞單位疫苗研發(fā)中同樣具有重要意義[14]。

2.分泌性抗原：結(jié)核分枝桿菌可以分泌大量蛋白到菌體外，有些分泌蛋白抑制宿主免疫應(yīng)答促進(jìn)免疫逃逸[15]，有些分泌蛋白則可以激活免疫信號(hào)通路誘導(dǎo)免疫應(yīng)答[16]。據(jù)報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌分泌的具有抗原性的蛋白有：Ag85復(fù)合物、早期分泌抗原靶6(ESAT-6)、培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)、MPT64、Rv3841、MPT63、Mtb8.4、KatG、Mtb81、MTB48、MTB12等。Ag85復(fù)合物由3種分泌蛋白Ag85A、Ag85B和Ag85C組成，其作為毒力因子有助于病原菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附、侵襲和播散，在結(jié)核分枝桿菌的致病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。ESAT-6是一種低相對(duì)分子質(zhì)量、早期分泌具有免疫原性較強(qiáng)的抗原，可以在結(jié)核分枝桿菌感染期持續(xù)表達(dá)，誘導(dǎo)較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答。CFP-10是一種結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液蛋白，能夠有效激活 T細(xì)胞免疫應(yīng)答[18]。Mtb10.4屬于ESAT-6家族成員，在結(jié)核病患者和BCG接種人群中可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫應(yīng)答[19]。分泌性抗原除了免疫原性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)外，還易于異源表達(dá)和制備，是理想的重組蛋白亞單位疫苗候選抗原。比如，Ag85B、ESAT-6和CFP-10在重組蛋白亞單位疫苗構(gòu)建中被廣泛應(yīng)用[15，20]，候選疫苗GamTBvac(Ag85A-ESAT-6-CFP-10/CpG ODN)處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)。

3.生長(zhǎng)期抗原和休眠期抗原：結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)周期，根據(jù)不同的代謝狀態(tài)可分為復(fù)蘇期、復(fù)制期和休眠期多個(gè)階段。在不同的代謝狀態(tài)下，結(jié)核分枝桿菌表達(dá)的抗原譜不盡相同，即每個(gè)生長(zhǎng)階段有不同的免疫優(yōu)勢(shì)抗原。據(jù)報(bào)道，結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇期優(yōu)勢(shì)表達(dá)抗原有Rv2787、Rv2450c、Rv1774、Rv1794等[21]；復(fù)制期優(yōu)勢(shì)表達(dá)抗原有Mtb10.4、Mtb8.4、ESAT6、Ag85B等[22]；休眠期優(yōu)勢(shì)表達(dá)抗原有HspX、Rv2626c、Rv2007c、Rv1738、Rv3130c等[23]。感染人體的結(jié)核分枝桿菌并不是單一代謝狀態(tài)，而是包含不同生長(zhǎng)階段的結(jié)核分枝桿菌，并且不同代謝狀態(tài)的細(xì)菌在一定條件下會(huì)相互轉(zhuǎn)換[24]。因此，理想的重組蛋白亞單位疫苗應(yīng)該是包含不同代謝狀態(tài)結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)抗原的多階段疫苗[25]。目前，多階段疫苗ID93(Rv2608-Rv3619-Rv3620-Rv1813)和H56(Ag85B-ESAT-6-Rv2660c)處于Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，且顯示出較好的臨床保護(hù)效果。筆者課題組用休眠期抗原HspX和Rv2626，分別與復(fù)制期抗原Mtb10.4、ESAT-6、Mtb8.4、Ag85B融合，構(gòu)建了多階段疫苗MH(Mtb10.4-HspX)、LT69(ESAT-6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Hspx)和LT70(ESAT-6-Ag85B-MPT64190-198-Mtb8.4-Rv2626c)，毒株攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示多階段疫苗比單一復(fù)制期抗原所構(gòu)建疫苗具有更好的保護(hù)效果[26-28]。

4.BCG缺失區(qū)抗原：通過(guò)比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，與牛分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株相比，BCG毒力降低的原因是缺失了編碼毒力因子的多個(gè)基因。這些缺失的基因組片段被稱為BCG缺失區(qū)(regions of deletion，RD)。結(jié)核分枝桿菌免疫保護(hù)性抗原ESAT-6、CFP-10、MPT64、Rv1978等都屬于BCG的RD區(qū)抗原[29]。此外，RD區(qū)抗原Rv3619c、Rv3620c、Rv3872、Rv3873、Rv1984、Rv3117、Rv2346c、Rv3425等也被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的免疫原性。BCG保護(hù)效果不理想，可能與丟失的大量編碼保護(hù)性抗原基因相關(guān)[30]。因此，重組蛋白亞單位疫苗構(gòu)建時(shí)，應(yīng)關(guān)注BCG缺失區(qū)抗原。

二、佐劑

免疫佐劑是重組蛋白亞單位疫苗設(shè)計(jì)的關(guān)鍵成分。結(jié)核分枝桿菌是胞內(nèi)寄生菌，體液免疫保護(hù)效果欠佳，需要誘導(dǎo)Th1和Th17型細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)對(duì)抗其感染。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)激動(dòng)劑可與蛋白或多肽結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫應(yīng)答[31-32]。目前，重組蛋白亞單位疫苗佐劑主要基于Toll樣受體激動(dòng)劑，如IC31由陽(yáng)離子抗菌肽KLKL5KLK和合成的TLR-9激動(dòng)劑寡脫氧核苷酸(oligodeoxynucleotide，ODN1a)組成[33-34]；AS01是由單磷酰脂A(monophosphoryl lipid A，MPL)和皂角苷(QS-21)組成的油包水型乳劑，其中，MPL為多糖解毒衍生物可激活TLR-4介導(dǎo)的天然免疫應(yīng)答[35-36]。GLA-SE為含吡喃葡萄糖基脂質(zhì)(glucopyranosyl lipid adjuvant，GLA)的角鯊烯水包油型乳劑，GLA為T(mén)LR-4激動(dòng)劑，可誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟和增強(qiáng)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答[37]。CpG ODN(CpG o1igodeoxynucleotides)是人工合成含有非甲基化胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脫氧核苷酸，其為T(mén)LR-9激動(dòng)劑，可通過(guò)增強(qiáng)抗原遞呈提高體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答[38]。筆者課題組應(yīng)用二甲基三十六烷基銨(dimo-thy-lidioctyl ammonium bromide，DDA)和TLR-3激動(dòng)劑聚肌胞苷酸(Poly Ⅰ:C)制備DDA-Poly Ⅰ:C(DP)佐劑。其中，DDA是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體，可將蛋白抗原遞呈給抗原遞呈細(xì)胞誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答；Poly Ⅰ:C是TLR-3激動(dòng)劑，可誘導(dǎo)天然免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。DP佐劑與結(jié)核分枝桿菌融合抗原聯(lián)合免疫小鼠，顯示出較好的佐劑效應(yīng)和安全性[39-40]。此外，干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)通路激活劑環(huán)二核苷酸可以誘導(dǎo)Th17型的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且顯示較強(qiáng)的抗結(jié)核保護(hù)效果[41]。因此，可考慮基于STING通路激活劑開(kāi)發(fā)更多的重組蛋白亞單位疫苗適用佐劑。

三、進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的重組蛋白亞單位疫苗及其保護(hù)效果

目前，全球至少有14種結(jié)核病疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，包括6種重組蛋白亞單位疫苗，分別是AEC/BC02、ID93/GLA-SE、GamTBvac、H56/IC31、H4/IC31和M72/AS01E。H4/IC31候選疫苗因保護(hù)效果不佳，已終止臨床試驗(yàn)[5]。AEC/BC02是國(guó)內(nèi)第一個(gè)進(jìn)入臨床試驗(yàn)的結(jié)核病疫苗，主要用于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染人群的免疫預(yù)防，目前已經(jīng)完成Ⅰ期臨床試驗(yàn)(NCT03026972)，正在開(kāi)展Ⅰb期臨床試驗(yàn)(NCT04239313)[42]。處于Ⅱa期臨床試驗(yàn)的候選疫苗有：(1)ID93/GLA-SE：在南非多地對(duì)接種過(guò)卡介苗的結(jié)核病患者，開(kāi)展免疫治療的臨床效果評(píng)價(jià)[43]。(2)GamTBvac：在一項(xiàng)包括180名接種過(guò)BCG的健康志愿者的臨床試驗(yàn)中，評(píng)價(jià)該疫苗的安全性和免疫原性[44]。臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，ID93/GLA-SE和GamTBvac候選疫苗均可在人體誘導(dǎo)持久的抗原特異性體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。處于Ⅱb期臨床試驗(yàn)階段的疫苗有：(1)H56/IC31候選疫苗：該疫苗經(jīng)Ⅰ期臨床試驗(yàn)評(píng)價(jià)，顯示出良好的安全性和較強(qiáng)的免疫原性[20]。Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，在感染和未感染結(jié)核分枝桿菌的成人中低劑量接種2次或3次，均可誘導(dǎo)持久的抗原特異性CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答[45]。(2)M72/AS01E候選疫苗：Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，在18～50歲的HIV陰性的結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者中，該疫苗對(duì)活動(dòng)性肺結(jié)核發(fā)病的保護(hù)率為54%(90%CI：14%～75%，P=0.04)[46-47]；但是，其3年的隨訪結(jié)果顯示保護(hù)率下降到49.7%(90%CI：12.1%～71.2%)[48]。上述疫苗在受試人群中可以誘導(dǎo)有效的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，均沒(méi)有觀察到出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，少數(shù)不良反應(yīng)為局部炎癥反應(yīng)和輕微的肌肉酸痛等。綜上所述，重組蛋白亞單位疫苗具有很好的安全性，并可具有一定的保護(hù)效力。

四、重組蛋白亞單位疫苗應(yīng)用策略

BCG接種主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生效應(yīng)記憶性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞。然而，效應(yīng)記憶性T細(xì)胞不能夠提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù)[49]。中央記憶性T細(xì)胞在疫苗長(zhǎng)期保護(hù)作用中發(fā)揮更為關(guān)鍵的作用[50]。據(jù)報(bào)道，重組蛋白亞單位疫苗具有成分單一、安全性高，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較多的中央記憶性T細(xì)胞[51]，因此，可作為強(qiáng)化疫苗用于加強(qiáng)BCG的效應(yīng)。以重組蛋白亞單位疫苗H56為例，在小鼠和食蟹猴感染模型采用BCG初免、重組蛋白亞單位疫苗加強(qiáng)免疫策略，結(jié)果表明，加強(qiáng)免疫的長(zhǎng)期保護(hù)效果明顯優(yōu)于BCG單獨(dú)免疫組[52-53]。BCG是我國(guó)免疫規(guī)劃預(yù)防接種疫苗，人群普遍接種，因此，重組蛋白亞單位疫苗作為強(qiáng)化疫苗應(yīng)用易被接受且符合我國(guó)國(guó)情。此外，重組蛋白亞單位疫苗LT69在小鼠體內(nèi)單獨(dú)免疫3次，在末次免疫后30周可提供與BCG相當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)效果[27]；H56在小鼠體內(nèi)單獨(dú)免疫3次，在末次免疫后24周可提供比BCG更好的保護(hù)效果[52]。因此，重組蛋白亞單位疫苗同樣具有單獨(dú)應(yīng)用替代BCG的應(yīng)用前景。

研究發(fā)現(xiàn)，在人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中采用皮內(nèi)注射BCG保護(hù)效果不佳[54]。在恒河猴體內(nèi)，與其他注射途徑(皮內(nèi)、皮下或氣霧)相比，靜脈注射BCG能夠提供更好的保護(hù)效果[55-56]。重組蛋白亞單位疫苗接種劑量和加強(qiáng)次數(shù)也是影響免疫效果的關(guān)鍵。重組蛋白亞單位疫苗通常需要多次加強(qiáng)免疫才能獲得有效的免疫記憶，但并不是加強(qiáng)次數(shù)越多越好，強(qiáng)化免疫次數(shù)太多可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生，降低疫苗的保護(hù)效果[57]。重組蛋白亞單位疫苗接種策略通常為間隔2周或3周加強(qiáng)免疫，即0-2-4或0-3-6周的3次免疫方案。筆者課題組研究發(fā)現(xiàn)，0-4-12周加強(qiáng)免疫的方案誘導(dǎo)的中央記憶性T細(xì)胞的數(shù)量更多[6]。因此，重組蛋白亞單位疫苗的最佳免疫途徑及策略還有待進(jìn)一步研究。

五、重組蛋白亞單位疫苗研究面臨的挑戰(zhàn)

建立有效動(dòng)物模型將為疫苗評(píng)價(jià)提供關(guān)鍵支撐。結(jié)核病候選疫苗通常在小鼠模型中進(jìn)行初步效果評(píng)價(jià)。此模型成本較低且易于基因改造獲得基因改造小鼠，但是小鼠和人的生理和免疫特征有較大的差距，不能模擬人類(lèi)結(jié)核分枝桿菌感染的真實(shí)狀態(tài)。獼猴與人的親緣關(guān)系更近，常用于結(jié)核病疫苗臨床前保護(hù)效果的評(píng)價(jià)，但是其購(gòu)買(mǎi)和飼養(yǎng)成本較高。豚鼠感染結(jié)核分枝桿菌后與人類(lèi)感染具有相似的病理特征，是結(jié)核病疫苗研究的良好動(dòng)物模型。但是該模型也存在可用的免疫檢測(cè)試劑有限、飼養(yǎng)條件要求高等缺點(diǎn)，因此，沒(méi)有作為結(jié)核病疫苗研究的主要?jiǎng)游锬Ｐ褪褂?。此外，人源化小鼠可克服上述?dòng)物模型的缺點(diǎn)，可用于評(píng)價(jià)結(jié)核病疫苗的動(dòng)物模型的建立[58]。

γ-干擾素等Th1型的細(xì)胞因子通常作為結(jié)核病疫苗評(píng)價(jià)的免疫檢測(cè)指標(biāo)，但是其與疫苗的保護(hù)效果和保護(hù)周期的相關(guān)性還沒(méi)有確切的定論。目前認(rèn)為，T細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)，尤其是中央記憶性T細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量決定疫苗的長(zhǎng)期保護(hù)效果。此外，黏膜分泌的分泌型免疫球蛋白A抗體可以阻斷結(jié)核分枝桿菌與巨噬細(xì)胞及上皮細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)揮保護(hù)性免疫作用[59]。因此，體液免疫，尤其是黏膜免疫在結(jié)核病疫苗保護(hù)中的作用也需關(guān)注。

六、總結(jié)與展望

BCG在臨床應(yīng)用有近百年的歷史，但是全球結(jié)核病疫情仍然十分嚴(yán)峻，提示結(jié)核病預(yù)防仍然缺乏高效的疫苗。在研的新型結(jié)核病疫苗中，重組蛋白亞單位疫苗可提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù)效果，且成分明確、安全性好，具有較好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)性抗原及佐劑的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步提高。目前，全球已有6種結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗正在開(kāi)展不同階段的臨床試驗(yàn)。雖然結(jié)核病重組蛋白亞單位疫苗的研究進(jìn)展令人鼓舞，但是其接種途徑、免疫策略和遞送系統(tǒng)等方面還有很多問(wèn)題需進(jìn)一步探索。