雷杰 王楠 牛群 謝貝 吳玲 鄧麗 劉志輝 孟繁榮

廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所呼吸疾病國家重點實驗室 510095

結(jié)核病作為一類慢性傳染性疾病，主要是由結(jié)核桿菌感染，在全球范圍內(nèi)流行，嚴(yán)重危害人類健康。化學(xué)療法［1］是治愈結(jié)核病和限制結(jié)核桿菌傳播的重要手段，找到一種能夠快速反映結(jié)核病化療療效的生物標(biāo)志物，實現(xiàn)對化療療效效果的監(jiān)控與評價顯得十分重要。近些年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，各種新型標(biāo)志物不斷被發(fā)現(xiàn)，它們的高敏感性、高特異性和快速性給結(jié)核病的化療監(jiān)控帶來新的期望，然而這些標(biāo)志物大都不能滿足臨床上對結(jié)核病化療監(jiān)控的全部要求。mpt64 是結(jié)核桿菌在生長早期大量分泌的特異性蛋白，可分泌至菌體外。mpt64 mRNA產(chǎn)生于結(jié)核桿菌合成mpt64分泌蛋白時，由結(jié)核桿菌內(nèi)的mpt64基因編碼并生成，屬于活菌體中極為重要的一個組成部分，同時mpt64 mRNA 有較短的半衰期，一般僅為數(shù)分鐘。由此可見，mpt64 mRNA作為一種監(jiān)控結(jié)核病化療療效的細菌學(xué)分子標(biāo)志物將大有可為。本研究探討mpt64 mRNA 作為結(jié)核化療細菌學(xué)監(jiān)控的分子標(biāo)志物可行性。

1 資料與方法

1.1 菌株 2021 年1 月至4 月，于廣州市胸科醫(yī)院分枝桿菌菌種庫中，隨機選取35 株對4 種一線抗結(jié)核藥物敏感的臨床分離株。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器 Middlebrook 7H9、Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基購自美國BD 公司，異煙肼購于瑞威爾生物科技有限公司，細菌總RNA 快速抽提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒（High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit）購自美國賽默飛世爾公司，實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測試劑盒（TB Green Fast qPCR Mix）購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。PCR 擴增儀（C1000TM Thermol cycle 系列）購自美國BIO RAD 公司，熒光定量PCR 擴增儀（Viia 7 DX）購自美國ABI公司。

1.2.2 實驗方法

1.2.2.1 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物處理結(jié)核分枝桿菌經(jīng)復(fù)蘇培養(yǎng)后選取Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基上處于對數(shù)期生長旺盛狀態(tài)良好的菌株，制成濁度為1 麥?zhǔn)系木鷳乙海?00.0 μl 菌液接種至10 ml 新鮮Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基，加入異煙肼藥液使培養(yǎng)基中藥物終濃度分別為0、0.2、0.5 μg/ml，37 ℃培養(yǎng)48 h后收集菌液3 ml，13 000 g離心10 min，菌體-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 總RNA 提取純化及反轉(zhuǎn)錄為保證RNA 提取效率一致，不同藥物濃度處理的標(biāo)本同時提取RNA。所用容器耗材均經(jīng)0.1%DEPC 水浸泡24 h，121 ℃高壓30 min處理，所有提取過程置于冰浴操作，提取過程遵照RNA 提取試劑盒說明書執(zhí)行，獲得的總RNA溶于20.0 μl DEPC水中。取10.0 μl 上述總RNA，加入2.0 μl 10×RT Buffer，0.8 μl 25×dNTP Mix（100 mM），2.0 μl 10X RT Random Primers，1.0 μl MultiScribe ?Reverse Transcriptase，1.0 μl RNase Inhibitor，3.2 μl DEPC 水配制成20.0 μl 反應(yīng)體系，置于PCR 儀中，反應(yīng)條件：25 ℃10min，37 ℃120 min，85 ℃5 min。

1.2.2.3 實時熒光定量PCRPCR 引物序列：正向5’GGTGATTGGCTTGCGATAGG3’，反向5’TGAATATCACCTCGGCCACA 3’，擴增片段長度152 bp，由北京六合華大基因科技有限公司生物合成。反應(yīng)體系20.0 μl，包括TB Green Fast qPCR Mix 10.0 μl、正反向引物各0.8 μl、Rox Reference Dye 0.3 μl、cDNA模板1.0 μl以及滅菌水7.1 μl。反應(yīng)條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃15 s，40 個循環(huán)并設(shè)立溶解曲線階段，每次反應(yīng)設(shè)陰性、陽性對照。結(jié)果判讀：擴增結(jié)束后，檢查溶解曲線為單一峰，設(shè)定基線范圍6.00～10.00，基線值0.01，判斷擴增曲線呈S 形，讀出cDNA的Ct值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)性分布，采用平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等進行描述性統(tǒng)計。獨立樣本t檢驗比較不同處理組間的差異性。檢驗水準(zhǔn)=0.05，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

所有樣本熒光定量PCR 檢測均出現(xiàn)了典型的擴增曲線，無藥處理組（C）mpt64 mRNA Ct 值為（25.34±2.56），0.2 μg/ml 異煙肼處理組（T1）mpt64 mRNA Ct 值為（29.09±3.25），0.5 μg/ml 異煙肼處理組（T2）mpt64 mRNA Ct 值為（30.14±3.23）。相較于無藥對照組，0.2 μg/ml異煙肼處理組mpt64 mRNA 增加（3.75±2.68）個Ct 值，0.5 μg/ml 異煙肼處理組增加（4.80±2.33）個Ct 值，mpt64 mRNA 表達水平降低，與無藥對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-5.37、-6.89，均P＜0.01）。0.2、0.5 μg/ml 兩個處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=-1.36，P=0.18）。具體見表1、圖1。

表1 35株對一線抗結(jié)核藥物敏感的臨床分離株不同處理組mpt64 mRNA實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)擴增Ct值

圖1 35株對一線抗結(jié)核藥物敏感的臨床分離株不同處理組mpt64 mRNA實時熒光定量PCR擴增Ct平均值柱形圖

3 討 論

眾所周知，臨床上治療結(jié)核病的方法是直接抗菌療法［2］，評價化療療效通常采用和診斷結(jié)核病相同的常規(guī)技術(shù)方法，包括細菌學(xué)、影像學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法［3-4］，各自方法具有不同的實際價值。痰涂片抗酸桿菌鏡檢和結(jié)核分枝桿菌分離培養(yǎng)操作簡便，設(shè)備費用要求低，是我國目前普及最廣的方法，但痰涂片抗酸桿菌鏡檢并不能區(qū)分出死活菌，傳統(tǒng)的改良羅氏培養(yǎng)法需要4～8 周時間，不能滿足臨床需要。胸部影像學(xué)檢查（X 線胸片、CT 片）是發(fā)現(xiàn)和診斷肺結(jié)核的重要方法之一，能準(zhǔn)確了解肺部病變部位的動態(tài)變化，尤其是對菌陰性肺結(jié)核［5-6］具有較高的敏感性，但肺部各種疾病的病變在胸部影像學(xué)檢查上特異性較差，容易造成定性困難。

近些年來，隨著免疫學(xué)技術(shù)與分子生物學(xué)的發(fā)展，各類分子標(biāo)志物層出不窮，它們的高敏感度、高特異度和快速性給結(jié)核病的化療監(jiān)控帶來新的期望。張雪等［7］、Tonby K等［8］的研究表明，血清干擾素誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）可作為臨床早期診斷活動性肺結(jié)核的檢測指標(biāo)，但Amanatidou V等［9］的研究表明，體內(nèi)IP-10水平可能存在一定的年齡依賴性，兒童體液免疫功能跟成人不同，IP-10 在兒童結(jié)核診斷中仍存在很多問題。

目前臨床上使用最廣泛的熒光定量PCR 檢測試劑盒大多數(shù)都是以IS6110 作為靶序列設(shè)計的，IS6110 作為結(jié)核桿菌DNA 基因組中一個多拷貝的保守片段，PCR 方法檢測敏感度與特異度較好。但也有研究顯示，PCR 方法檢測易受如實驗條件的設(shè)置、引物的設(shè)計、標(biāo)本的類型不同和處理方法不同等多方面因素的影響，且有些菌株中缺乏IS6110，易造成假陰性結(jié)果。另外，結(jié)核分枝桿菌DNA 分子穩(wěn)定，半衰期長，平臺效應(yīng)強，TB-DNA 不能區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核。

結(jié)核桿菌RNA 分子半衰期短，僅存在于活動性的菌體中，檢測RNA 水平的變化用于結(jié)核病化療療效的監(jiān)測［10-11］有著天然的優(yōu)勢。目前臨床上使用最廣泛的恒溫擴增實時熒光檢測技術(shù)（SAT）就是檢測結(jié)核桿菌菌內(nèi)核糖體RNA（rRNA），但研究表明，rRNA 分子穩(wěn)定，具有平臺效應(yīng)且半衰期遠大于mRNA。85B mRNA 編碼結(jié)核桿菌85B 蛋白，特異性強［12］，活菌細胞含量豐富，但相關(guān)研究顯示，由于藥物靶位效率不同，利福平對85B mRNA的表達量有著明顯的抑制作用，產(chǎn)生出多藥方案中利福平掩蓋其他藥物的預(yù)示作用。因此，上述標(biāo)志物用于評價結(jié)核病化療療效監(jiān)控均不理想。mpt64 mRNA 產(chǎn)生于結(jié)核桿菌合成mpt64 分泌蛋白時，由結(jié)核桿菌內(nèi)的mpt64 基因編碼并生成，屬于活菌體中極為重要的一個組成部分，同時mpt64 mRNA 有較短的半衰期，其更新時間一般僅為數(shù)分鐘。另外mpt64 蛋白只會存在于具有致病性的結(jié)核桿菌中，具有特異性。因此，有望通過監(jiān)測mpt64 mRNA的變化，監(jiān)測結(jié)核桿菌濃度的變化。

本研究結(jié)果顯示，相對于無藥處理組，異煙肼處理組結(jié)核桿菌mpt64 mRNA表達水平均低于無藥處理組，0.2 μg/ml異煙肼處理組mpt64 mRNA 增加（3.75±2.68）個Ct 值，0.5 μg/ml 異煙肼處理組增加（4.80±2.33）個Ct 值，與無藥處理組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），說明在短時間內(nèi)，異煙肼可以抑制結(jié)核桿菌mpt64 mRNA的表達，mpt64 mRNA的分子表達水平與結(jié)核桿菌的活動情況有關(guān)；兩個處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明結(jié)核桿菌mpt64 mRNA的表達水平與異煙肼藥物濃度無關(guān)。

值得注意的是，有研究顯示，mpt64 蛋白在部分結(jié)核桿菌中存在不表達的情況，導(dǎo)致假陰性的產(chǎn)生，其原因主要是mpt64 mRNA基因發(fā)生整體缺失和突變的情況，直接造成結(jié)核菌無法正常合成mpt64 mRNA［13］。本研究在引物的設(shè)計過程中，選擇了比較保守的基因片段，對mpt64 mRNA的擴增均避開了易突變位點，不存在檢測不到的情況，有效保障了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

綜上，mpt64 mRNA表達水平可在短時間內(nèi)反映出藥物對結(jié)核桿菌的作用效果，有望成為結(jié)核病化療療效監(jiān)測的分子標(biāo)志物，作為結(jié)核病化療療效評價的一個重要細菌學(xué)監(jiān)控工具。本研究的不足之處是，未對結(jié)核桿菌藥物敏感株進行更長時間的培養(yǎng)，缺少更長時間下mpt64 mRNA 變化情況的監(jiān)測，在后續(xù)工作中會繼續(xù)加強研究，如周期更長的臨床標(biāo)本驗證以及與培養(yǎng)法檢測結(jié)果的對比分析等，提供更為全面的數(shù)據(jù)支持。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。