柯霓 黃耿 葉志華 姜衛(wèi)東 王蕾

1鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院超聲影像科 435000；2鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科 435000；3腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黃石 435000

腎癌是最常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，源自腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮［1］。早期腎癌患者通常沒有癥狀，多數(shù)腎癌患者被診斷時(shí)已處于中晚期，因而腎癌患者預(yù)后較差［2］。腎癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制并不完全明確，探究其分子機(jī)制有助于開發(fā)新的腎癌診斷和治療方法。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一種非蛋白質(zhì)編碼RNA，長度大于200 個(gè)核苷酸，廣泛參與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾、基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控［3-4］。lncRNA 通過影響許多基因的表達(dá)，在腫瘤如腎癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［5-6］。AC051619.8是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，長度為308個(gè)核苷酸，其在腎癌中的研究未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過檢測過表達(dá)AC051619.8 對腎癌細(xì)胞增殖和遷移的影響，探討AC051619.8在腎癌發(fā)生和發(fā)展中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和主要試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司。腎癌細(xì)胞系OS-RC-2 購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞所。胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司。攜帶AC051619.8 序列的重組慢病毒和攜帶無意義序列的重組慢病毒購自廣州銳博生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）試劑盒購自日本TaKaRa公司。四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色（MTT）試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。細(xì)胞黏附分子1（cell adhesion molecule 1，CADM1）、GAPDH、Zeb-1、CDK6 抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和感染 OS-RC-2 腎癌細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，接種在12 孔細(xì)胞板。設(shè)計(jì)分組：分別感染攜帶無意義序列的重組慢病毒（NC組）和攜帶AC051619.8 序列的重組慢病毒（AC051619.8組），48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.3 RT-qPCR檢測AC051619.8 和CADM1 mRNA的表達(dá) 加入TRIzol 試劑裂解各組細(xì)胞，抽提總RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)RT-qPCR 試劑盒說明書進(jìn)行檢測，RT-qPCR 引物見表 1。以 GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算AC051619.8 和CADM1 mRNA的相對表達(dá)量，采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列

1.4 MTT 法檢測OS-RC-2 細(xì)胞增殖 胰酶消化兩組OS-RC-2 細(xì)胞，計(jì)數(shù)后每孔以5×103個(gè)接種到96 孔板，每組3個(gè)平行孔。將含有MTT試劑的培養(yǎng)基加入每孔并培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，加入140 μl/孔二甲基亞砜進(jìn)行溶解，酶標(biāo)儀檢測每孔在460 nm 處的吸光度值（A490值）。于接種后第1、2、3、4天進(jìn)行MTT法檢測，繪制OS-RC-2細(xì)胞生長曲線。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測OS-RC-2 細(xì)胞遷移 采用無血清培養(yǎng)基重懸兩組OS-RC-2 細(xì)胞，接種于6 孔板。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到95%，使用10 μl 槍頭在6 孔板底部進(jìn)行直線劃痕，加入2 ml/孔無血清培養(yǎng)基，在顯微鏡下記錄劃痕距離L1。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，在顯微鏡下記錄劃痕距離L2，OS-RC-2細(xì)胞遷移率=（L1－L2）/L1×100%。

1.7 Western blot 檢測CADM1及NF-κB 信號通路蛋白表達(dá) 采用具有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取兩組OS-RC-2細(xì)胞總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，采用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉。將膜分別與一抗在4 ℃下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 h，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑，曝光、檢測蛋白條帶。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒感染后OS-RC-2 細(xì)胞中AC051619.8的表達(dá) NC組和 AC051619.8組 OS-RC-2 細(xì)胞中AC051619.8 相對表達(dá)量分別為（1.03±0.13）和（9.78±1.07），兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.10，P＜0.01），提示攜帶AC051619.8序列的慢病毒感染成功。

2.2 上調(diào)AC051619.8 對OS-RC-2 細(xì)胞增殖能力的影響 MTT檢測結(jié)果顯示，與NC組相比，AC051619.8組OS-RC-2 細(xì)胞從第2 天開始，增殖能力顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組重組慢病毒上調(diào)AC051619.8對OS-RC-2細(xì)胞增殖能力的影響

2.3 上調(diào)AC051619.8 對OS-RC-2 細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NC組和AC051619.8組OS-RC-2細(xì)胞遷移率分別為（58.68±4.01）%和（25.22±5.38）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.99，P＜0.01）。與NC組相比，上調(diào)AC051619.8后OS-RC-2細(xì)胞的遷移被抑制。

2.4 上調(diào)AC051619.8 對OS-RC-2 細(xì)胞中CADM1 mRNA 表達(dá)的影響 NC組和AC051619.8組OS-RC-2 細(xì)胞中CADM1 mRNA 相對表達(dá)量分別為（1.05±0.18）和（5.71±0.47），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.22，P＜0.01）。與NC組相比，上調(diào)AC051619.8 可促進(jìn)OS-RC-2 細(xì)胞中CADM1 mRNA的表達(dá)。

2.5 上調(diào)AC051619.8 對CADM1 蛋白表達(dá)的影響Western blot 結(jié)果顯示（圖2），與NC組相比，上調(diào)AC051619.8 后，OS-RC-2 細(xì)胞中CADM1 蛋白表達(dá)明顯增加，細(xì)胞增殖蛋白CDK6 表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白Zeb-1 表達(dá)降低。

圖2 兩組重組慢病毒W(wǎng)estern blot 檢測AC051619.8 對CADM1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

近年來，lncRNA 在腎癌中的作用已有很多報(bào)道［7］。lncRNA 如 PCGEM1［8］、NORAD［9］、MIR4435-2HG［10］、FGD5-AS1［11］等在腎癌組織和細(xì)胞系中異常表達(dá)，與腫瘤患者的臨床分期、分級、預(yù)后顯著相關(guān)。lncRNA 已成為腎癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。AC051619.8 是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在腎癌中的作用和分子機(jī)制并不明確。本研究通過感染慢病毒構(gòu)建AC051619.8穩(wěn)定高表達(dá)的OS-RC-2細(xì)胞系，過表達(dá)AC051619.8 后的OS-RC-2 細(xì)胞增殖和遷移能力均顯著降低，提示AC051619.8可能是腎癌的抑癌lncRNA。

CADM1 蛋白包含442 個(gè)氨基酸，屬于細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白家族成員，CADM1 可通過非依賴鈣鎂離子途徑影響細(xì)胞間黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。CADM1 蛋白在結(jié)腸癌、乳腺癌、宮頸癌等多種腫瘤組織均呈低表達(dá)，上調(diào)CADM1 可明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，CADM1 發(fā)揮明顯的腫瘤抑制因子作用［13-14］。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)AC051619.8 后，OS-RC-2 細(xì)胞中 CADM1 表達(dá)明顯增加，表明AC051619.8 可促進(jìn)CADM1 蛋白表達(dá)。Western blot 結(jié)果顯示，AC051619.8 上調(diào)CADM1 表達(dá)后，細(xì)胞增殖蛋白CDK6 表達(dá)降低，細(xì)胞遷移蛋白Zeb-1 表達(dá)降低，提示OS-RC-2細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯降低。

綜上所述，過表達(dá)AC051619.8 能抑制腎癌細(xì)胞的增殖和遷移，AC051619.8 可能是腎癌的抑癌lncRNA，CADM1 可能是AC051619.8的作用靶點(diǎn)。AC051619.8 研究為進(jìn)一步理解腎癌的發(fā)病機(jī)制提供了參考。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。