李穎 王友軍 劉榴 張培培

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院兒科 450000

新生兒窒息是引起足月新生兒急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）最常見的原因，也是引起新生兒死亡和兒童傷殘的重要因素之一［1-2］。得益于呼吸支持如無創(chuàng)/有創(chuàng)通氣的發(fā)展與肺泡表面活性物質(zhì)的使用，新生兒呼吸衰竭的病死率極大地降低［3-4］。但迄今對新生兒窒息后急性肺損傷（acute lung injury，ALI）發(fā)病機(jī)制的研究國內(nèi)外報(bào)道較少，針對新生兒ALI的診斷及治療體系仍然不完整。

降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是迄今發(fā)現(xiàn)的體內(nèi)擴(kuò)血管作用最強(qiáng)的神經(jīng)肽，廣泛分布于肺、心、腦等組織，研究表明其能誘導(dǎo)多類細(xì)胞的增殖與分化，抑制炎癥擴(kuò)散，參與呼吸道的自我修復(fù)等過程［5］。CGRP 是用分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)的第1 個活性多肽［6-7］。但其確切的作用機(jī)制尚不十分明了，通過對近足月鼠阻斷子宮血管而誘發(fā)短期胎盤缺血，提供一個損傷時間和誘導(dǎo)方式與圍生期窒息相似的模型。本研究于利用此動物模型，探討宮內(nèi)急性缺血缺氧對新生大鼠肺組織CGRP表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 孕齡21 d的Wistar大鼠7只，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)系統(tǒng)鼠籠中，控制溫度（24±1）℃、相對濕度55%～65%，保持12 h明/12 h暗周期，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑與儀器 2.5%戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司）；（125I-CGRP）放射免疫試劑盒（北京前塵生物科技有限公司）；瓊脂糖（北京雷根生物技術(shù)有限公司）；脂多糖（sigma 公司）；蘇木素伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色試劑盒（碧云天公司）；EzgenoTMtotal RNA Kit 試劑盒（GENEMEGA 公司）；PCR 所用引物的設(shè)計(jì)（Invitrogen 生物有限公司）；UVI 全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 公司，美國，ChemiDocTM XRS）；勻漿器（IKA 公司，德國，IKA MS3）；冰凍切片機(jī)（德國萊卡儀器有限公司）；PCR 儀（Thermo 公司，美國，Roche Lightcycler480II）；熒光顯微鏡（德國ZEISS 光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 缺血缺氧動物模型的制備與分組 參閱文獻(xiàn)的方法，用2.5%戊巴比妥鈉（0.1～0.2 ml/100 g）腹腔注射麻醉，剖腹21 d的Wistar 大鼠的一側(cè)子宮角的血管（卵巢及宮頸兩端均結(jié)扎），結(jié)扎一側(cè)的宮內(nèi)胎鼠為缺血缺氧組，另外一側(cè)子宮角的血管不予結(jié)扎，其宮內(nèi)胎鼠為假手術(shù)對照組。分別于剖腹后20、30 和40 min 時從兩側(cè)子宮中各取出1 只胎鼠，另外設(shè)21 d 正常剖腹胎鼠為正常對照組，分為7組，每組6只，共剖出42只胎鼠。

1.2.2 肺組織標(biāo)本留取 各組小鼠分別于20、30 和40 min 從母鼠中取出，立即處死，在無菌條件下開胸取出肺組織，置無RNase的Eppendorf 管中，于液氮中速凍后，保存于-80 ℃冰箱中凍存待測CGRP mRNA表達(dá)水平。

1.2.3 肺組織病理改變 肺組織經(jīng)過石蠟包埋，切成4 μm 切片，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)改變。

1.2.4 肺組織勻漿中CGRP 含量測定 取胎鼠右中下肺組織，立即稱重并且加入1.5 ml的生理鹽水于勻漿器中制成勻漿，在4 ℃下進(jìn)行離心，以3 000 轉(zhuǎn)/min 離心30 min，取離心后的上清液置于-80 ℃下保存。肺組織勻漿中CGRP 含量測定：采用放射免疫法檢測肺組織勻漿CGRP 含量。用125 碘標(biāo)記降鈣素基因相關(guān)肽（125I-CGRP）放射免疫試劑盒用γ 計(jì)數(shù)器測定CGRP的放射性并且計(jì)算CGRP的蛋白含量。

1.2.5 RT-PCR 檢測肺組織a-CGRP mRNA、β-CGRP mRNA 表達(dá)的檢測 取凍存的鼠肺組織50 mg，采用GENEMEGA 公司EzgenoTMtotal RNA Kit 試劑盒說明提取肺組織總RNA，RT-PCR（試劑盒購自TaKaRa 試劑公司）擴(kuò)增目的片斷。磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參照物。引物參照文獻(xiàn)并由Invitrogen 生物有限公司合成。a-CGRP引物正向鏈：5-CCTGGTTGTCAGCATCTTGC-3，反向鏈5-CACATTGGTGGGCACAAAGT-3，擴(kuò)增長度 316 bp（328-347，CGRPmRNA，Genbank Accesion No.M1 1597）；β-CGRP 引物正向鏈：5-CTGGCTCTCAGCAGCATGTG-3，反向鏈：5-CA-CATTGGTGGGCACAAAGT-3，擴(kuò)增長度333 bp（346-365’，β-CGRP，Genbank Accession No.M11596）；內(nèi)參照物β-actin正向鏈：5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’，反向鏈 ：5'-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3’，擴(kuò)增長度422 bp。擴(kuò)增條件：94 ℃9 min，35 個循環(huán)（94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃2 min），72 ℃10 min，最后降溫至4 ℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后。利用UVI 全自動凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad 公司）對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行掃描。以內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)化β-actin 比較，得到a-CGRP mRNA、β-CGRP mRNA的相對表達(dá)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胎鼠肺組織病理變化 正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡大小均勻一致，肺泡間隔薄；缺血缺氧組可以看到肺泡結(jié)構(gòu)不完整，肺組織細(xì)支氣管和小血管周圍間質(zhì)水腫、疏松，有少量炎性細(xì)胞滲出；肺泡腔內(nèi)有以嗜中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞、紅細(xì)胞、大量粉紅色的蛋白滲出物和水腫液，并隨著缺血缺氧時間的延長，病理改變越明顯。見圖1。

圖1 脂多糖處理6 h 后正常對照組與缺血缺氧組幼鼠肺組織鏡下病理改變（A 為正常對照組，B 為缺血缺氧組，HE染色 ×200）

2.2 GCRP 在缺血缺氧小鼠中的mRNA 表達(dá)水平 正常對照組、假手術(shù)對照組、缺血缺氧組a-CGRP 平均表達(dá)水平在同一時間點(diǎn)相比，缺血缺氧組較正常對照組明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；假手術(shù)對照組較正常對照組上升，在缺氧20 min 時差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在缺氧30 min、40 min時，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。正常對照組、假手術(shù)對照組、缺血缺氧組β-CGRP 平均表達(dá)水平在同一時間點(diǎn)相比，缺血缺氧組較正常對照組明顯上升，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；假手術(shù)對照組較正常對照組上升，在缺氧20 min 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在缺氧30 min、40 min 時，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 3組新生胎鼠肺組織中各時相點(diǎn)a-CGRP mRNA和β-CGRP mRNA表達(dá)比較（）

表1 3組新生胎鼠肺組織中各時相點(diǎn)a-CGRP mRNA和β-CGRP mRNA表達(dá)比較（）

注：CGRP為肺組織降鈣素基因相關(guān)肽，正常對照組：正常胎鼠，假手術(shù)對照組：子宮角未結(jié)扎一側(cè)胎鼠，缺血缺氧組：子宮角結(jié)扎一側(cè)胎鼠

2.3 CGRP 在缺血缺氧小鼠中的蛋白表達(dá)水平 正常手術(shù)對照組、假手術(shù)對照組與缺血缺氧組肺組織CGRP的表達(dá)水平在同一時間節(jié)點(diǎn)相比，缺血缺氧組比正常對照組明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），假手術(shù)對照組與缺血缺氧組相比升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 3組新生胎鼠肺組織中各時相點(diǎn)CGRP水平比較（）

表2 3組新生胎鼠肺組織中各時相點(diǎn)CGRP水平比較（）

注：CGRP為肺組織降鈣素基因相關(guān)肽，正常對照組：正常胎鼠，假手術(shù)對照組：子宮角未結(jié)扎一側(cè)胎鼠，缺血缺氧組：子宮角結(jié)扎一側(cè)胎鼠

3 討 論

新生兒特別是早產(chǎn)兒易發(fā)生肺損傷繼而出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，嚴(yán)重可造成支氣管肺發(fā)育不良，新生ALI 最常見于發(fā)生于宮內(nèi)，出生后可持續(xù)發(fā)展。ALI在臨床兒科中較為常見，是由多種原因?qū)е碌姆尾考毙詮浡該p傷，主要病理表現(xiàn)為急性肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和彌散性肺泡上皮細(xì)胞損傷，肺間質(zhì)水腫與炎癥介質(zhì)的釋放［8］。但肺部損傷的機(jī)制不是十分清晰。目前已知胎糞吸入可以導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)滅活，進(jìn)而導(dǎo)致肺泡表面活性物質(zhì)缺乏而引起新生兒ALI，這一機(jī)制在小鼠中已經(jīng)成功構(gòu)建模型［9］。新生兒ALI 在缺血缺氧在早期診斷、治療等方面都需要更加細(xì)致的探討。

CGRP 是一個由37 個氨基酸殘基組成的感覺神經(jīng)肽，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)中。CGRP有兩種可獲得的異構(gòu)體——α-CGRP 和β-CGRP，分別來自不同的基因，在人類和大鼠中二者相差了3個氨基酸［10］。β-CGRP主要存在于腸神經(jīng)系統(tǒng)中，而α-CGRP 存在于感覺神經(jīng)元中，在對腺苷酸環(huán)化酶刺激和細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷形成方面，α-CGRP 和β-CGRP的作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CGRP 是肺組織內(nèi)最豐富的神經(jīng)肽之一，肺內(nèi)有豐富的CGRP 神經(jīng)纖維，廣泛存在于肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和肺的神經(jīng)纖維中，參與體內(nèi)多種生物功能調(diào)節(jié)，如保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、減少氧自由基產(chǎn)生、抑制炎癥因子生成、促進(jìn)心房鈉尿肽釋放等多種作用［11-12］。目前為止，CGRP 對于新生兒肺損傷的保護(hù)作用的機(jī)制尚未清楚。因此我們探討了CGRP 在新生大鼠缺血缺氧導(dǎo)致的ALI 中抗炎作用。本研究中，我們成功建立新生小鼠缺血缺氧模型，比較了在不同缺血缺氧時間下小鼠中的CGRP的表達(dá)水平。通過本實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)在急性缺血缺氧的小鼠模型中，缺血缺氧組較其他兩組CGRP 表達(dá)水平明顯升高，這說明在缺血缺氧情況下新生小鼠肺組織CGRP 水平升高，并且隨著時間的延長，CGRP的水平隨之增高，但是并不呈線性關(guān)系，可見CGRP 對缺血缺氧下ALI具有一定的保護(hù)作用。在ALI 中，存在有許多抗炎介質(zhì)，如血管活性腸肽［13］和環(huán)氧三烯酸［14］，這些抗炎介質(zhì)發(fā)揮著減輕炎癥的作用。研究表明CGRP 也具有十分強(qiáng)大的抗炎作用，例如CGRP能減輕脂多糖（LPS）所致ALI，相關(guān)報(bào)道表明外源性CGRP可降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量，對LPS 誘導(dǎo)的ALI 大鼠具有抗炎作用［15］。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞在肺部炎癥中具有重要作用［16］，它通過產(chǎn)生趨化因子白細(xì)胞介素（IL）-8 和單核細(xì)胞趨化蛋白-1，幫助吸收炎癥細(xì)胞到肺部對抗腫瘤壞死因子（TNF）-α 和IL-1β 等炎癥因子的反應(yīng)，AEII 細(xì)胞來源的CGRP 還可以自分泌/旁分泌模式抑制IL-1β誘導(dǎo)的IL-8分泌。進(jìn)一步的研究也表明，CGRP減弱了IL-1β 引起的活性氧形成，是促炎因子信號傳導(dǎo)的早期跡象［17］。也有相關(guān)報(bào)道表明CGRP 調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化，抑制炎性反應(yīng)［18］。近年來有學(xué)者推測肺水腫的發(fā)生與水通道蛋白有關(guān)系，有相關(guān)研究表明，CGRP 能夠增加AQP1 和AQP5的表達(dá)，減輕肺水腫，對ALI 幼鼠肺損傷具有保護(hù)作用［19］，然而CGRP 是直接還是間接促進(jìn)水通道蛋白還需要進(jìn)一步研究。CGRP8-37是降鈣素原相關(guān)肽受體的拮抗劑，對于LPS 誘導(dǎo)的ALI，CGRP8-37 可促進(jìn)炎癥和增強(qiáng)肺損傷。同時LPS 可誘導(dǎo)更嚴(yán)重肺水腫伴AQP1 下調(diào)，用CGRP8-37 預(yù)處理可加重病情［20］。這些結(jié)果也提示內(nèi)源性CGRP的潛力對于治療ALI 具有重要意義。通過構(gòu)建宮內(nèi)缺血缺氧導(dǎo)致的肺損傷的小鼠模型，我們推測CGRP 在缺血缺氧肺損傷中起著重要的保護(hù)作用，減輕炎性反應(yīng)，可能通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)、減輕肺水腫等方面減輕肺損傷，但是其詳細(xì)機(jī)制還有待于研究，這為我們治療宮內(nèi)缺血缺氧導(dǎo)致新生兒肺損傷提供了治療的思路。

利益沖突：作者已申明文章無相關(guān)利益沖突。