牛海帆 馬寧

1 山東省濟(jì)寧市兗州區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科 272100；2 承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北067000

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是目前臨床內(nèi)分泌科常見(jiàn)的糖尿病并發(fā)癥，除糖代謝異常外，還會(huì)出現(xiàn)水腫、蛋白尿等一系列腎小球?yàn)V過(guò)功能異常，占糖尿病并發(fā)癥的30%～35%［1］。隨著飲食及生活習(xí)慣改變，糖尿病發(fā)病率逐年上升，DN 已成為終末期腎臟病的首要原因，因此積極防治具有重要意義。蛋白尿是DN 診斷及治療效果評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，但目前臨床尚缺乏降低蛋白尿的有效治療途徑［2］。

DN 屬中醫(yī)“消渴病”范疇，研究發(fā)現(xiàn)黃芪散能夠有效降低尿蛋白及血糖水平，并且降低蛋白尿作用可能獨(dú)立于降糖作用［3］。古方黃芪散由葛根、黃芪、桑白皮組成，以“益氣養(yǎng)陰”之法在治療消渴病方面獲得滿(mǎn)意臨床療效，但作用機(jī)制尚不清晰，本研究通過(guò)結(jié)合Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)差異基因分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從靶基因及信號(hào)通路角度對(duì)古方黃芪散治療DN 可能作用機(jī)制進(jìn)行全面探究，以期為DN的臨床治療及研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 依據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取黃芪散符合生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類(lèi)藥性（drug likeness，DL）≥0.18的活性成分，并通過(guò)PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取對(duì)應(yīng)SMILES 結(jié)構(gòu)。并將結(jié)構(gòu)輸入Swiss Target Prediction 及Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，相似性閾值取0.85。經(jīng)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換基因名稱(chēng)去重整合后，利用Cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)。

1.2 差異基因分析 以“Diabetic Nephropathy”為關(guān)鍵詞檢索GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)，確定GSE30529 包含12 個(gè)正常腎臟組織樣本，10 個(gè)DN組織樣本；GSE30528 包含13 個(gè)正常腎臟組織樣本，9個(gè)DN組織樣本。利用生物信息學(xué)之RMA算法背景校正和矩陣數(shù)據(jù)歸一化處理其原始文件，利用limma包二次分析芯片數(shù)據(jù)結(jié)合P＜0.05和差異倍數(shù)logFC絕對(duì)值＞1進(jìn)行篩選，最終獲得DN的差異表達(dá)基因。

1.3 疾病基因預(yù)測(cè) 以“Diabetic Nephropathy”作為關(guān)鍵詞，采用疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)（GeneCards）、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）以及綜合型藥物數(shù)據(jù)庫(kù)（DrugBank）對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，合并各數(shù)據(jù)庫(kù)及1.2中差異基因，即獲得DN相關(guān)靶點(diǎn)。

1.4 核心靶點(diǎn)查找 將黃芪散靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)映射生成Venny 圖，獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)，并借助String 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接自由度（degree）值的大小進(jìn)行篩選，得到黃芪散治療DN的核心靶基因。

1.5 基因可視化 將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID），進(jìn)行京都基因與基因組大百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析以及基因本體論（gene ontology，GO）生物過(guò)程的富集分析。以P≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別將篩選出的前20 個(gè)GO 條目與KEGG條目，借助OmicShare云平臺(tái)繪制富集分析氣泡圖。

2 結(jié) 果

2.1 成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 篩選到活性成分葛根18個(gè)、黃芪87個(gè)、桑白皮194個(gè)。根據(jù)ADME參數(shù)進(jìn)一步篩選活性成分葛根4 個(gè)、黃芪20 個(gè)、桑白皮32 個(gè)，去重整合后共50 個(gè)。最后PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)具有SMILES 結(jié)構(gòu)的活性成分15 個(gè)，見(jiàn) 表1。獲得預(yù)測(cè)靶 點(diǎn)151個(gè)，借助Cytoscape3.7.2構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪散的活性成分-靶點(diǎn)圖

表1 黃芪散活性成分表

2.2 差異基因分析 差異基因分析顯示GSE30529 芯片有393 個(gè)基因存在表達(dá)差異，其中上調(diào)基因283 個(gè)，下調(diào)基因110 個(gè)，火山圖見(jiàn)圖2、熱圖見(jiàn)圖3；GSE30528 芯片有317個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因82個(gè)，下調(diào)基因235個(gè)，火山圖見(jiàn)圖4、熱圖見(jiàn)圖5。

圖2 GSE30529火山圖

圖3 GSE30529熱圖

圖4 GSE30528火山圖

圖5 GSE30528熱圖

2.3 疾病基因預(yù)測(cè) 各數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到疾病靶點(diǎn)DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)62 個(gè)（score≥0.3），GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)1 538 個(gè)（relevance≥5），OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)200 個(gè)以及DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)11 個(gè)，合并各數(shù)據(jù)庫(kù)及2.2 中差異基因，共獲得DN相關(guān)靶點(diǎn)2 082個(gè)。

2.4 核心靶點(diǎn)查找 黃芪散靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交叉生成Venny圖（圖6），通過(guò)Venny圖可以直觀發(fā)現(xiàn)黃芪散與DN共有55 個(gè)重合基因，表明此類(lèi)靶點(diǎn)在治療DN 方面具有顯著特異性。將這55 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖（圖7），在55 個(gè)節(jié)點(diǎn)在0.4 中置信度下有309 條相互作用關(guān)系，根據(jù)degree≥15 篩選到核心靶點(diǎn)16 個(gè)（圖8）。蛋白激酶B 1（AKT1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）、雌激素受體α（ESR1）等位于PPI 作用網(wǎng)絡(luò)中心位置，具有較高自由度，可能是黃芪散作用于DN的核心靶點(diǎn)。

圖6 黃芪散靶點(diǎn)與糖尿病腎病交叉生成Venny圖

圖7 關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 核心靶點(diǎn)圖

2.5 基因可視化 將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)行基因可視化，經(jīng)P≤0.05 篩選后，GO 富集出生物過(guò)程（BP）69 項(xiàng)，分子功能（MF）31 項(xiàng)，細(xì)胞成分（CC）10 項(xiàng)。KEGG 信號(hào)通路富集出42 條通路可能在抗DN 方面發(fā)揮有重要作用。取各項(xiàng)前20條以氣泡圖的形式展現(xiàn)出來(lái)（圖9、10）。

圖9 GO富集結(jié)果氣泡圖

3 討 論

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)黃芪散與DN 之間含大量重疊靶基因，在DN 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有重要地位。AKT1 具有復(fù)雜生理功能，在調(diào)控細(xì)胞周期、蛋白合成、血管構(gòu)建以及胰島素依賴(lài)的細(xì)胞代謝等方面均具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者腎纖維化過(guò)程中伴有AKT1的異常表達(dá)與合成，并且對(duì)高糖環(huán)境誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)表型轉(zhuǎn)換過(guò)程至關(guān)重要，阻斷AKT 信號(hào)分子，則能抑制此過(guò)程，改善腎纖維化［4］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)選擇性敲除足細(xì)胞EGFR 后，會(huì)抑制高糖環(huán)境誘導(dǎo)的足細(xì)胞自噬，并顯著降低蛋白尿、腎小球硬化及腎臟促炎細(xì)胞因子的表達(dá)［5］。因此推測(cè)黃芪散可能通過(guò)抑制EGFR 表達(dá)，進(jìn)而保護(hù)足細(xì)胞，減輕DN 患者蛋白尿。SRC 是與DN 相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的整合者，腎小球系膜基質(zhì)蛋白膠原蛋白積聚是DN的典型特征。有研究表明，SRC 激酶抑制高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞EGFR的轉(zhuǎn)激活和膠原合成，并預(yù)防DN［6］。在DN 引起終末期腎病絕經(jīng)后女性占重要比例，因此推測(cè)雌激素與DN的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［7］。雌激素通過(guò)特異性結(jié)合ESR1 抑制血管緊張素2 及內(nèi)皮素代謝合成，進(jìn)而調(diào)控腎臟血管收縮，改善炎癥水平［8］。同時(shí)雌激素還能夠調(diào)控MAPK/AP-2 通路下游靶點(diǎn)，改善內(nèi)皮細(xì)胞纖維化水平，延緩DN病理過(guò)程［9］。大量文獻(xiàn)研究表明，黃芪散內(nèi)含大量靶基因涉及細(xì)胞自噬、炎性反應(yīng)、膠原合成及雌激素代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)，參與DN的發(fā)生發(fā)展。

圖10 KEGG信號(hào)通路氣泡圖

對(duì)核心靶點(diǎn)行基因GO分析發(fā)現(xiàn)黃芪散治療DN是通過(guò)調(diào)節(jié)一氧化氮合成酶活性、酶結(jié)合、蛋白酪氨酸激酶活性等分子功能來(lái)實(shí)現(xiàn)調(diào)控凋亡過(guò)程、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄等生物過(guò)程。KEGG 通路富集分析顯示，雌激素信號(hào)通路、Ras 相關(guān)蛋白1（Rap1）信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）信號(hào)通路等可能是DN 發(fā)揮作用的主要特異性通路。調(diào)控雌激素信號(hào)通路在治療DN 過(guò)程中具有重要作用，流行病學(xué)顯示女性較男性而言患終末期腎病風(fēng)險(xiǎn)更高，并且腎損傷動(dòng)物模型中，雌性受到的影響更少。Seppi 等研究發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)前婦女包括雌激素在內(nèi)的生殖激素能夠促進(jìn)腎小管細(xì)胞增殖、修復(fù)，抵抗腎損傷；Inada 等進(jìn)一步認(rèn)為雌激素能夠更加有效控制血糖水平，改善DN 帶來(lái)的腎損傷［10］。高糖環(huán)境能夠增加腎小管活性氧生成，進(jìn)一步引起腎小球硬化及腎小管萎縮等糖尿病并發(fā)癥。Rap1 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移、黏附及增殖等多種生物功能，研究表明Rap1b 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能來(lái)調(diào)節(jié)活性氧生成過(guò)程，改善腎小管損傷并減慢DN的進(jìn)程［11］。甲狀腺激素在腎臟的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要調(diào)控作用，甲狀腺功能障礙是DN發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，甲亢或者甲減均會(huì)激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)，引起腎小球率過(guò)濾改變影響腎功能［12］。有研究表明，T3 能夠上調(diào)糖尿病小鼠模型腎臟磷脂酰肌醇3 激酶活性來(lái)減少尿白蛋白排泄、改善腎臟結(jié)構(gòu)損傷，并且DN 患者的游離三碘甲狀腺原氨酸（free triiodothyronine，F(xiàn)T3）水平降低，因此推測(cè)FT3 通過(guò)抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)干預(yù)DN的損傷［13］。HIF-1 通路和血管生長(zhǎng)因子（VEGF）通路是DN 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中重要通路，李慧等［14］研究發(fā)現(xiàn)尿蛋白與血清HIF-1α 和VEGF 呈負(fù)相關(guān)，并且聯(lián)系緊密，能夠加速DN發(fā)展。長(zhǎng)期高糖環(huán)境引起腎小球微循環(huán)障礙、血流動(dòng)力改變，同時(shí)紅細(xì)胞攜氧能力下降導(dǎo)致組織缺血缺氧。HIF-1α 作為HIF1的亞基，早期能夠使組織細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，而DN 不斷發(fā)展時(shí)高血糖會(huì)抑制HIF-1α生成，并促使其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)激活下游VEGF通路調(diào)控血管生成、增加通透性，進(jìn)一步加重蛋白尿［15］。因此阻斷HIF-1及VEGF通路信號(hào)傳導(dǎo)具有深遠(yuǎn)意義。

目前對(duì)DN的發(fā)病機(jī)制研究已日趨成熟，本研究通過(guò)結(jié)合GEO差異基因分析及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)黃芪散通過(guò)作用于AKT1、EGFR、SRC、ESR1 等多個(gè)靶點(diǎn)調(diào)控雌激素通路、Rap1 通路、甲狀腺激素通路及HIF-1 通路等多條特異性通路干預(yù)DN的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為DN 研究及治療提供了一定理論依據(jù)。但此類(lèi)信息整合研究準(zhǔn)確性依托于新技術(shù)及各數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善及發(fā)展，具體機(jī)制仍需實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步確定。