秦桂福 吳琪 宋玉 吳高明 李俟琪

骨肉瘤(Osteosarcoma，OS)是一種間葉組織來源的好發(fā)于兒童和青少年的骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤，保肢手術(shù)和新輔助化療的綜合治療是骨肉瘤患者常用的治療手段，化療藥物對殺傷腫瘤細胞、預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)具有重要意義[1-2]。臨床上常用的骨肉瘤化療藥物如順鉑(Cisplatin)具有腎毒性和嚴重嘔吐的毒副作用及腫瘤耐藥性，限制其長期使用，是影響化療效果的主要因素[3]。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物，降低傳統(tǒng)化療藥物的使用劑量，可為骨肉瘤的治療提供更好的策略和方向[4]。

蘿藦科植物徐長卿的根及根莖或帶根全草，性溫、味辛，歸肝、胃經(jīng)，有較強的祛風止痛、溫經(jīng)通絡(luò)和解郁活血的功效，丹皮酚是徐長卿的主要有效成分，研究發(fā)現(xiàn)其在體外對多種腫瘤細胞有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用[5]。PI3K/Akt/mTOR信號通路的表達失調(diào)與腫瘤細胞增殖分化、腫瘤血管形成轉(zhuǎn)移、化療耐藥性關(guān)系密切[6-7]。本研究通過探討徐長卿丹皮酚(Paeonol)聯(lián)合順鉑對骨肉瘤MG-63細胞增殖、遷移和凋亡的影響，揭示PI3K/Akt/mTOR通路磷酸化與骨肉瘤細胞增殖、遷移和凋亡的關(guān)系，為臨床上徐長卿丹皮酚和順鉑的聯(lián)合用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

徐長卿丹皮酚(上海阿拉丁公司，批號H111081，純度>99%)；順鉑(美國Sigma公司，批號P4394，純度>99%)；0.25% Trypsin、胎牛血清(美國Gibco公司，批號分別為15050065和10099-141)；CCK8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(美國MCE公司，批號HY-K0301)；Transwell(美國BD Biosciences公司，批號353097)；多聚甲醛、TEMED、SDS(國藥集團化學試劑有限公司，批號分別為80096618、80125336、30166428)；細胞凋亡檢測試劑盒(南京Vazyme有限公司，批號A113-03)；DAPI、磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號分別為C1002、S1873、P0013B、P0010)；抗熒光淬滅封片劑(美國Southernbiotech公司，批號0100-01)；Trise-Base(德國Biofroxx公司，批號1115GR500)；蛋白marker(上海百賽生物技術(shù)有限公司，批號P12103-2)；PVDF膜(美國Millipore公司，批號IPVH00010)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司，批號AB-P-R 001)；兔單抗p-Akt、兔單抗mTOR(美國CST公司，批號分別為13038、2983S)；兔多抗Akt(江蘇親科生物研究中心有限公司，批號AF6261)；兔單抗p-mTOR(英國Abcam公司，批號Ab137133)；HRP標記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號BA1054)；ECL底物液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號P1050)。

1.2 儀器

ThermoFisher微量移液器、5702R型低速離心機(德國Eppendorf公司)；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO電氣公司)；Flexstation?3型全自動酶標儀(美國Molecular Devices分子儀器公司)；IX51型倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；德國Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機；武漢俊杰JK-6生物組織攤烤片機；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽、DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠)；mμlISKANMK3酶標儀(美國Thermo公司)；T8-1型磁力攪拌器(江蘇省金壇市中大儀器廠)；TS-1水平搖床(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；HI650離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；CPA電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.3 細胞

骨肉瘤細胞系MG-63，購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司，貨號CL-0157，傳至第3～5代用于實驗。

1.4 方法

1.4.1細胞培養(yǎng) 取生長狀態(tài)良好的MG-63細胞，使用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行各項實驗。

1.4.2CCK8比色法檢測細胞活力 以5×104個/mL密度接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，37 ℃培養(yǎng)過夜(在細胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL無菌PBS)。分為6組：空白組(不加藥物)、順鉑(4 μmol/L)組、徐長卿丹皮酚(0.3 mmol/L)組、徐長卿丹皮酚不同濃度(0.3，0.6，1.2 mmol/L)聯(lián)合順鉑(4 μmol/L)組；每組5個復(fù)孔，37 ℃分別培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入10 μL CCK8，37 ℃培養(yǎng)4 h，酶標儀測定各孔吸光值OD 450，根據(jù)公式計算細胞活力。計算公式：增殖抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。計算兩藥相互作用指數(shù)(Coefficient of Drug Interaction，CDI)，公式為[8]CDI=AB/(AXB)，AB=兩藥聯(lián)合組A值/對照組A值；A(或B)=兩藥單獨使用組A值/對照組A值。CDI<1時兩藥有協(xié)同作用，CDI<0.7時協(xié)同作用非常明顯。

1.4.3細胞劃痕法檢測MG-63細胞遷移 取已按1.4.2節(jié)分組處理完畢的各組細胞，0.25%胰酶分別消化計數(shù)約為5×105個細胞，接種于6孔板，確保第2天可以鋪滿，將槍頭比著直尺，盡量垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗細胞3次，加入無血清培養(yǎng)基，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0 h和24 h拍照，用Image-Pro Plus 軟件分析，以最大距離與最小距離的平均值來評估細胞遷移程度。

1.4.4Transwell法檢測MG-63細胞侵襲 細胞分組同1.4.2節(jié)，細胞培養(yǎng)24 h后收集細胞，0.25%胰酶消化，終止消化后離心去上清，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞濃度至5×104個/mL，在24孔板中預(yù)先加入800 μL含10%FBS 的培養(yǎng)基(含雙抗)，并放入Transwell小室，1 h后在Transwell上室分別接入200 μL各組細胞懸液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)的未遷移的細胞擦干凈，用10%甲醇溶液固定細胞30 min。切膜后用5%結(jié)晶紫染液染色20 min，PBS清洗后顯微鏡下觀察，拍照計數(shù)。

1.4.5TUNEL法檢測MG-63細胞凋亡 細胞分組同1.4.2節(jié)，細胞培養(yǎng)24 h后收集細胞，將爬好細胞的玻片浸入4%多聚甲醛溶液，室溫固定25 min后用PBS洗滌3次。每個爬片滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，室溫孵育20 min。用去離子水溶液潤洗爬片，滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區(qū)域，室溫孵育15 min。在平衡細胞的同時在冰上解凍BrightRed Labeling Mix，準備TdT孵育緩沖液。將載玻片置于濕盒內(nèi)，在37 ℃下孵育60 min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光，用PBS洗滌3次。滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行復(fù)染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.4.6Western Blot法檢測MG-63中Akt和mTOR的蛋白磷酸化水平 將實驗分為6組：空白組(不加藥物)、順鉑(4 μmol/L)組、徐長卿丹皮酚(0.3 mmol/L)單獨組、徐長卿丹皮酚不同濃度(0.3，0.6，1.2 mmol/L)聯(lián)合順鉑(4 μmol/L)組。細胞培養(yǎng)24 h后收集細胞，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取蛋白，于4 ℃下12 000 r/min離心5 min后收集上清為蛋白懸浮液。將蛋白樣品和BSA標準蛋白進行適當稀釋后，加入BCA試劑盒混合液，用DG-3022A酶標儀測定OD568，利用回歸方程計算出樣品蛋白濃度。采用加熱法進行蛋白變性，用10%SDS-PAGE進行電泳。取出凝膠根據(jù)Marker切下目的條帶，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5% 脫脂奶粉的TBST封閉2 h，分別加入GAPDH(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Akt(1∶500)、p-mTOR(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST充分洗滌PVDF膜，再加入用HRP標記的二抗(1∶50 000稀釋)，室溫搖床孵育2 h。TBST洗膜后，ECL顯影、定影，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑增強抑制骨肉瘤細胞增殖

CCK8結(jié)果顯示，與空白組比較，徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑組、順鉑和徐長卿丹皮酚單獨給藥組隨著作用時間的延長，細胞增殖抑制率有不同程度的增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；與順鉑組比較，徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑各組細胞增殖抑制率逐漸增加，呈時間和濃度依賴性，兩藥存在協(xié)同作用，CDI<1，且作用72 h后徐長卿丹皮酚1.2 mmol/L聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞增殖抑制作用最強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，CDI<0.7，協(xié)同效應(yīng)非常明顯。提示徐長卿丹皮酚和順鉑聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞增殖，其抑制作用與徐長卿丹皮酚濃度及作用時間相關(guān)，且明顯強于順鉑和徐長卿丹皮酚單獨給藥組(見表1)。

表1 各組骨肉瘤細胞增殖抑制率

2.2 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞遷移的影響

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑給藥可顯著抑制骨肉瘤細胞遷移，并具有一定的濃度依賴性，其抑制作用強于順鉑和徐長卿丹皮酚單獨給藥組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2及圖1。

表2 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞遷移的影響

圖1 徐長卿丹皮酚增強順鉑抑制骨肉瘤細胞遷移能力

2.3 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞侵襲的影響

與空白組比較，各藥物組細胞的侵襲數(shù)目均顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。與順鉑組比較，徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，并具有一定的濃度依賴性，見表3及圖2。

圖2 徐長卿丹皮酚增強順鉑抑制骨肉瘤細胞侵襲能力(200×)

表3 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞侵襲的影響

2.4 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞凋亡的影響

不同濃度徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑作用骨肉瘤細胞24 h，熒光顯微鏡下觀察4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后MG-63細胞核的形態(tài)變化，可見空白組細胞核為橢圓形藍色均勻熒光，隨著徐長卿丹皮酚濃度的增加，呈紅色熒光凋亡細胞明顯增多，以徐長卿丹皮酚中、高濃度與順鉑聯(lián)用最明顯。與空白組比較，各藥物組骨肉瘤細胞的凋亡率均顯著升高(P<0.05，P<0.01)。與順鉑組比較，徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑給藥隨著藥物濃度升高，細胞凋亡率呈升高趨勢(P<0.05，P<0.01)，具有一定的濃度依賴性(見表4及圖3)。

表4 各組骨肉瘤細胞凋亡率

圖3 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞凋亡的影響(200×)

2.5 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對MG-63細胞中Akt和mTOR蛋白磷酸化水平的影響

Western Blot結(jié)果表明：徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑干預(yù)24 h后，Akt、mTOR蛋白的表達水平變化不明顯；p-Akt、p-mTOR表達水平隨徐長卿丹皮酚濃度增大而減少，提示徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑可顯著抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化水平，具有一定的濃度依賴性，并且其抑制作用強于順鉑單獨給藥組(P<0.01)，見圖4。

圖4 徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞中AKT和mTOR蛋白磷酸化水平的影響

3 討論

近年來隨著對骨肉瘤病理、影像及藥理等研究的深入，臨床上對于局限性骨肉瘤患者，經(jīng)規(guī)范診療后5 a生存率可達60%，然而因其具有高轉(zhuǎn)移和增殖能力，臨床治療中容易復(fù)發(fā)、治療效果不佳[9-10]。化療藥物的毒副作用及腫瘤多藥耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。中藥在治療骨肉瘤方面歷史悠久，從中尋找治療骨肉瘤的藥物有廣闊的應(yīng)用前景[11]。

文獻報道顯示[12]，徐長卿是經(jīng)動物實驗和臨床驗證后對骨腫瘤有肯定療效的藥物之一，是骨腫瘤中醫(yī)證候分型中濕毒留滯型、瘀血內(nèi)阻型和瘀毒熱結(jié)型的配伍方藥[13]，主要藥理成分丹皮酚藥理作用廣泛，包括解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)細胞免疫、抑制血小板聚集、抗血栓形成及中樞抑制作用，且其不良反應(yīng)少，而近年來丹皮酚的抗腫瘤活性逐漸被證實。研究發(fā)現(xiàn)，丹皮酚能抑制人肝癌細胞Bel-7404的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其作用機制可能與通過抑制PI3K通路，上調(diào)抑癌基因PTEN的表達，下調(diào)抑癌基因Akt的表達有關(guān)[14]。研究證實，丹皮酚能顯著抑制人卵巢癌SKOV3細胞增殖，促進其凋亡，其機制可能和調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Survivin、Caspase-3的表達變化相關(guān)[15]。研究表明，丹皮酚通過誘導(dǎo)細胞凋亡抑制乳腺癌細胞生長，其機制可能與啟動線粒體凋亡途徑有關(guān)[16]。

本研究用不同濃度的徐長卿丹皮酚(0.3，0.6，1.2 mmol/L)聯(lián)合順鉑處理骨肉瘤MG-63細胞后，CCK-8結(jié)果顯示，與空白對照組和順鉑單獨給藥組相比，徐長卿丹皮酚不同濃度聯(lián)合順鉑各組細胞增殖抑制率逐漸增加，呈時間和濃度依賴性，且作用72 h后徐長卿丹皮酚1.2 mmol/L聯(lián)合順鉑對骨肉瘤細胞增殖抑制作用最強，CDI<0.7，說明徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑有協(xié)同抑瘤作用。用細胞劃痕和Transwell實驗檢測不同濃度徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑對MG-63細胞遷移和侵襲的影響，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的遷移能力和侵襲能力，并具有一定的濃度依賴性，且其抑制作用強于順鉑單獨給藥組。用TUNEL法檢測MG-63細胞凋亡，隨著徐長卿丹皮酚濃度的增加，呈紅色熒光凋亡細胞有明顯增多的趨勢，以徐長卿丹皮酚中、高濃度與順鉑聯(lián)用最明顯，結(jié)果提示徐長卿丹皮酚協(xié)同順鉑促進骨肉瘤MG-63細胞凋亡。

為進一步探討徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑協(xié)同抗骨肉瘤的作用機制，用Western Blot法檢測骨肉瘤MG-63中PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)信號蛋白Akt和mTOR的磷酸化水平，結(jié)果表明：徐長卿丹皮酚聯(lián)合順鉑可能通過抑制Akt、mTOR蛋白磷酸化，發(fā)揮協(xié)同抑瘤作用，并具有一定的濃度依賴性，但對Akt、mTOR總蛋白表達無影響。