劉圓園,曹啟航,孫亞楠,委慧玲,薛惠文,茍惠天
(甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院,甘肅 蘭州 730070)
單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,簡稱LM)也稱單增李斯特菌,是一種重要的人畜共患病原菌,它主要以食物為傳播媒介,是最致命的食源性病原體之一,其致死率高達30%[1-2],對人類安全構成很大威脅。研究顯示,已有16種血清型被鑒定出來,主要有3種血清型常見于感染中,分別是譜系Ⅰ中4b型、1/2b型以及譜系Ⅱ中1/2a型菌株[3-4]。LM作為一種胞內寄生菌,能刺激宿主產生免疫應答,并誘導CD8+T和CD4+T特異性細胞免疫應答。CD8+T 細胞可分泌穿孔素、顆粒酶及釋放γ干擾素(IFN-γ),CD4+T細胞產生Th1 細胞因子[5-6]。人主要通過糞-口途徑感染李斯特菌,同時通過眼睛、黏膜和破損的皮膚也可感染[7-8]。LM入侵宿主細胞的過程極其復雜,涉及致病因子、黏附分子、內化素等多種蛋白分子[9]。
內化素(internalin,Inl)是LM中一個由基因編碼的蛋白家族。目前己知有25種內化素,其中InlA和InlB為最早鑒定出的與細菌侵襲相關的內化素蛋白[10]。它們與LM毒力有著密切的關系,是參與細菌入侵宿主細胞的主要因子,其功能是對宿主的黏附、侵襲作用[11]。InlA通過與宿主的特異性受體E-cad相互作用來介導LM內化入上皮細胞內,使LM內吞而進入宿主的上皮細胞[12-13]。InlB可以與宿主細胞表面多種受體作用介導LM黏附、侵襲肝細胞及非吞噬細胞[14]。目前,研究表明僅有部分內化素在介導LM入侵時起作用[15-17]。Balandyte等[18]研究發(fā)現,InlG蛋白主要存在于環(huán)境分離菌株中,很少存在于LM臨床分離的人和動物源菌株中,表明InlG在LM適應宿主外環(huán)境和生存息息相關;InlG屬于大分子量的內化素,C端是含有LPXTG 結構的內化素,通過碳末端與細菌細胞壁相連,其基因的表達不受prfA的控制。有研究結果顯示InlGHE基因簇的缺失導致對小鼠肝臟和脾臟的定植能力降低,細菌毒力顯著性下降,表明基因簇與細菌致病力相關[19]。蔣建軍[20]從133株單增李斯特菌分離株中研究發(fā)現InlG在譜系Ⅰ中不存在,譜系Ⅱ、Ⅲ中分別為74.2%和30.7%。胡楊峰[21]從分離的236株單增李斯特菌中發(fā)現inlG基因占41.1%。關于inlG基因在LM的致病力方面的研究較少,其功能需要進一步驗證。因此,本試驗以LM為材料,克隆inlG基因后進行測序比對,構建重組原核表達質粒,誘導表達蛋白,并免疫小鼠后以LM攻毒,評價免疫效果,旨在為進一步研究inlG基因功能奠定基礎。
LM標準菌ATCC19111(禽源)購于中國普通微生物菌種保藏中心 (中國,北京),原核表達載體pET-28a(+)由本實驗室保存,兔抗LM陽性血清由本實驗室制備,7周齡昆明雄性小鼠購于蘭州獸醫(yī)研究所動物中心,腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)購自北京Solarbio科技有限公司,大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術有限公司。
細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA Marker、TMB底物顯色液均購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD19-T載體、限制性內切酶EcoRⅠ、HindⅢ和T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司;預染蛋白分子質量標準購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑購自Sigma公司(美國);超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物均購自OXOID公司(英國)。其余試劑皆為國產分析純產品。
參照GenBank中公布的inlG基因序列,設計inlG基因的特異性引物,其中InlG-F為上游引物,下劃線部是EcoRⅠ的酶切位點。InlG-R為下游引物,下劃線部位是HindⅢ的酶切位點,上游引物序列為:5′-CCGGAATTCATGAAACAGAGAAAAACCTCAGTA-3′;下游引物序列為:5′-CCCAAGCTTTTAAATGTTAGTAGTTTTTTTTCG-3′,擴增片段預期大小為1 473 bp。引物由金唯智生物公司合成。
將-80 ℃凍存的標準株LM在BHI固體培養(yǎng)基四區(qū)劃線培養(yǎng),挑取單個菌落培養(yǎng)12~14 h,提取基因組。已提取LM基因組為模板,設計合成的上游引物InlG-F、下游引物InlG-R擴增基因inlG片段。反應體系為:上、下游引物各1 μL、基因組1 μL、ddH2O 9.5 μL、2×PCR Mix 12.5 μL,總體積25 μL。反應條件為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用DNA膠回收試劑盒回收inlG基因片段,與pMD19-T在16 ℃過夜連接,后轉化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng),篩選陽性克隆送金唯智生物公司測序。
將pMD19-T-InlG經EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切后回收inlG基因,pET-28a(+)經雙酶切后回收,連接轉化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng),挑取單個菌落鑒定陽性的重組質粒。
pET-28a(+)-InlG轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中,在卡那抗性的LB固體培養(yǎng)板上恒溫培養(yǎng),挑取單個菌落振蕩培養(yǎng)14~16 h,以一定比例接種于5 mL液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8時,加入1.0 mmol/L的IPTG誘導6 h,收集誘導后的菌液經SDS-PAGE分析重組蛋白表達情況。
1.6.1 重組蛋白表達條件優(yōu)化
分3組優(yōu)化表達條件:將菌液接種到液體培養(yǎng)基中,加入不同濃度誘導劑(0.5、0.7、0.9、1.0和1.2 mmol/L的IPTG),37 ℃誘導表達6 h;不同溫度(16、28、30和41 ℃)誘導表達14 h;不同時間(6、8、10、12和14 h)誘導表達,分別收集處理誘導并超聲后的樣品。將上清和沉淀樣品處理后經SDS-PAGE,分析蛋白表達形式。
1.6.2 表達產物的純化
將誘導表達后的菌液處理、SDS-PAGE后,考馬斯亮藍染色,表達后的蛋白切膠條送往上海鹿明生物科技有限公司進行質譜鑒定。質譜鑒定后應用Ni-NTA親和純化層析柱純化目的蛋白(操作參照試劑盒說明),SDS-PAGE分析表達純化結果。
經SDS-PAGE分離后,切膠移至NC膜上,90 V濕轉60 min后,用PBST洗滌NC膜3次后,LM兔陽性血清用PBST按1∶1 000稀釋,將NC膜轉移到稀釋好的血清里37 ℃孵育1 h;用PBST洗滌3次后,加入稀釋好的1∶5 000的羊抗兔IgG,于37 ℃放置2 h,最后用化學發(fā)光試劑盒顯色。以誘導前的全菌作為陰性對照。
1.8.1 LM對小鼠的半數致死量(LD50)測定
將LM在BHI培養(yǎng)基中劃線,挑取單個菌落培養(yǎng),測定OD600為1.0時,收集菌體用滅菌生理鹽水洗滌3次后,調至不同濃度進行平板計數。昆明小鼠60只,6~8周齡均為雌性,隨機分成6組,即:5個劑量組和1個對照組,每組10只。不同濃度菌分別腹腔注射小鼠,每只小鼠注射0.1 mL,感染小鼠菌量分別為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105CFU/只,對照組小鼠注射同等體積滅菌生理鹽水,在注射后不同時間段對小鼠進行觀察。通過寇氏法計算LM對小鼠的LD50。
1.8.2 小鼠免疫及抗體效價測定
將7周齡雄性健康小鼠隨機分為試驗組和對照組,每組16只。純化的InlG蛋白定量加弗氏完全佐劑乳化后,以100 μg/只的劑量多點皮下注射試驗組小鼠,每只小鼠注射0.2 mL,對照組注射等體積的生理鹽水,2組小鼠于相同條件下飼喂14 d后,試驗組改為弗氏不完全佐劑加強免疫1次,免疫方法、劑量同第1次免疫;免疫后小鼠斷尾采血,分離血清,檢測效價。以InlG蛋白作為抗原包被于酶標板,利用間接ELISA方法檢測小鼠抗體水平。
1.8.3 攻毒試驗
測定效價后,用2 LD50的LM進行攻毒,LM經滅菌生理鹽水洗滌3次,制備成菌懸液后腹腔注射給小鼠,觀察記錄小鼠精神狀態(tài),統(tǒng)計各組小鼠的存活率。
瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR產物大小為1 473 bp,與預期相符(圖1)。
M.DNA分子質量標準;1. inlG基因;2.陰性對照
重組表達載體pET-28a(+)-InlG經EcoRⅠ與Hind Ⅲ雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳分析得到,雙酶切后有約5 400 bp的載體條帶和1 473 bp的目的條帶,大小與預期結果相符(圖2)。
M. DNA分子質量標準;1. pET-28a(+)-InlG;2. pET-28a(+)-InlG的雙酶切產物;3. inlG基因
經IPTG誘導后,收集處理菌體,經SDS-PAGE,在70 ku處有蛋白條帶,誘導前的pET-28a-InlG菌液處理后未出現蛋白條帶。pET-28a-InlG優(yōu)化表達條件后,經SDS-PAGE分析(圖3),IPTG終濃度為1.0 mmol/L時,37 ℃誘導表達6 h后,表達量較高,表達產物主要為可溶性蛋白。
M. 預染蛋白質分子質量標準;1. pET-28a-InlG誘導前全菌;2. pET-28a-InlG誘導后全菌;3. pET-28a-InlG誘導后上清;4. pET-28a-InlG誘導后沉淀;5. 純化后的重組蛋白
預測InlG蛋白分子量約為53 ku,但經SDS-PAGE可見大小約70 ku,與理論預期不符。誘導表達的蛋白切膠條質譜鑒定結果與LM參考序列比對,其覆蓋度和得分都比較高,肽段覆蓋率可達79%,可進行下一步試驗。
以LM陽性血清為一抗,羊抗兔IgG為二抗,結果顯示誘導后蛋白與LM陽性血清反應出現特異性條帶,未誘導的全菌未出現條帶(圖4),說明重組蛋白具有良好的反應原性。
M. 蛋白質分子質量標準;1. pET-28a-InlG誘導前全菌;2. pET-28a-InlG誘導后全菌
不同劑量LM菌液注射小鼠后,根據每組小鼠死亡數計算死亡率(表1),根據寇氏法計算出LM的LD50為1.0×106.6CFU。
表1 小鼠半數致死量測定
InlG重組蛋白為包被抗原,間接ELISA檢測InlG蛋白免疫小鼠的抗體效價可達1∶52 000以上。LM腹腔感染小鼠后,對照組小鼠被毛粗糙、扎堆、精神萎靡,個別小鼠逐漸出現顫栗、眼角分泌物增多、呼吸頻率加快和耳朵出血癥狀,15只小鼠72 h內陸續(xù)死亡,1只小鼠存活,存活率為6.25%。試驗組中8只小鼠出現相似癥狀并陸續(xù)死亡,另外8只小鼠于攻毒后48 h開始恢復正常并存活下來,存活率為50%。
LM是重要的食源性人獸共患病原菌,其致病性與毒力因子相關。LM可穿越感染宿主的3道屏障,即腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障,感染過程與多種毒力因子和酶有關,如:內化素、p60蛋白、表面蛋白p104、纖連蛋白結合蛋白A、酰胺酶(Ami)、自溶素(Auto)等[22]。因此,研究與LM內化素相關毒力因子,對了解LM的致病原理和李斯特菌病的防治具有重要意義。
inlG基因編碼490個氨基酸,預測分子量約為53 ku,經SDS-PAGE檢測發(fā)現InlG蛋白約為70 ku,與預期相差17 ku,但InlG蛋白經質譜鑒定后,質譜結果與LM參考序列覆蓋度和得分都比較高。蛋白質電泳結果大小和預測值存在偏差,分析可能與預染蛋白分子質量標準在不同濃度SDS-PAGE條件下蛋白分離的效率有關。蛋白經水煮變性處理后會形成棒狀結構,表面均勻吸附離子,大小不同的蛋白形成相應的“棒狀”體,SDS-PAGE時通過分子篩和電荷效應被分離。實際上,不同的蛋白由于氨基酸組成等原因,并不符合這一基本假設,因此有時會出現如上偏差。
用2 LD50的LM(1×108CFU)活菌腹腔感染小鼠,試驗組16只小鼠死亡8只。分析小鼠死亡原因,試驗中LM菌株是致病性較強的1/2a血清型,另外也可能與InlG蛋白免疫小鼠后產生的保護力不夠有關。本試驗只選取內化素家族的單個InlG進行免疫保護性研究試驗。吳金花等[23]構建了奶牛乳腺炎無乳鏈球菌sip、pgk及fbsA基因主要抗原區(qū)域的融合表達,融合表達蛋白可具備Sip、Pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保護性試驗中,重組融合抗原對攻毒小鼠的保護優(yōu)于單個蛋白。姜秀云等[24]研究發(fā)現牛分枝桿菌mpb51與mpb70基因融合一起,純化的融合蛋白比單一蛋白具有更高的抗原反應性。下一步可將內化素家族具有優(yōu)勢抗原表位的基因進行串聯表達,研究串聯基因表達的蛋白是否具有良好的抗原性。雖然InlG蛋白具有一定的抗原保護性,但在本試驗中未與其他內化素(InlA和InlB等)的保護性進行比較,InlG蛋白是否有黏附、侵襲等特性還有待進一步研究。
綜上,本研究成功表達出LM的InlG蛋白,該蛋白具有良好的反應原性。重組蛋白制備成亞單位疫苗免疫小鼠,小鼠能產生較高滴度的抗體,表明InlG蛋白具有良好的免疫原性,且對小鼠有一定的免疫保護性。研究結果為探討inlG基因生物學功能和李氏桿菌病的防控奠定基礎。