劉圓園，曹啟航，孫亞楠，委慧玲，薛惠文，茍惠天

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，簡稱LM)也稱單增李斯特菌，是一種重要的人畜共患病原菌，它主要以食物為傳播媒介，是最致命的食源性病原體之一，其致死率高達(dá)30%[1-2]，對人類安全構(gòu)成很大威脅。研究顯示，已有16種血清型被鑒定出來，主要有3種血清型常見于感染中，分別是譜系Ⅰ中4b型、1/2b型以及譜系Ⅱ中1/2a型菌株[3-4]。LM作為一種胞內(nèi)寄生菌，能刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并誘導(dǎo)CD8+T和CD4+T特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。CD8+T 細(xì)胞可分泌穿孔素、顆粒酶及釋放γ干擾素(IFN-γ)，CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th1 細(xì)胞因子[5-6]。人主要通過糞-口途徑感染李斯特菌，同時通過眼睛、黏膜和破損的皮膚也可感染[7-8]。LM入侵宿主細(xì)胞的過程極其復(fù)雜，涉及致病因子、黏附分子、內(nèi)化素等多種蛋白分子[9]。

內(nèi)化素(internalin，Inl)是LM中一個由基因編碼的蛋白家族。目前己知有25種內(nèi)化素，其中InlA和InlB為最早鑒定出的與細(xì)菌侵襲相關(guān)的內(nèi)化素蛋白[10]。它們與LM毒力有著密切的關(guān)系，是參與細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞的主要因子，其功能是對宿主的黏附、侵襲作用[11]。InlA通過與宿主的特異性受體E-cad相互作用來介導(dǎo)LM內(nèi)化入上皮細(xì)胞內(nèi)，使LM內(nèi)吞而進(jìn)入宿主的上皮細(xì)胞[12-13]。InlB可以與宿主細(xì)胞表面多種受體作用介導(dǎo)LM黏附、侵襲肝細(xì)胞及非吞噬細(xì)胞[14]。目前，研究表明僅有部分內(nèi)化素在介導(dǎo)LM入侵時起作用[15-17]。Balandyte等[18]研究發(fā)現(xiàn)，InlG蛋白主要存在于環(huán)境分離菌株中，很少存在于LM臨床分離的人和動物源菌株中，表明InlG在LM適應(yīng)宿主外環(huán)境和生存息息相關(guān)；InlG屬于大分子量的內(nèi)化素，C端是含有LPXTG 結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素，通過碳末端與細(xì)菌細(xì)胞壁相連，其基因的表達(dá)不受prfA的控制。有研究結(jié)果顯示InlGHE基因簇的缺失導(dǎo)致對小鼠肝臟和脾臟的定植能力降低，細(xì)菌毒力顯著性下降，表明基因簇與細(xì)菌致病力相關(guān)[19]。蔣建軍[20]從133株單增李斯特菌分離株中研究發(fā)現(xiàn)InlG在譜系Ⅰ中不存在，譜系Ⅱ、Ⅲ中分別為74.2%和30.7%。胡楊峰[21]從分離的236株單增李斯特菌中發(fā)現(xiàn)inlG基因占41.1%。關(guān)于inlG基因在LM的致病力方面的研究較少，其功能需要進(jìn)一步驗證。因此，本試驗以LM為材料，克隆inlG基因后進(jìn)行測序比對，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白，并免疫小鼠后以LM攻毒，評價免疫效果，旨在為進(jìn)一步研究inlG基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基、實驗動物及血清

LM標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC19111(禽源)購于中國普通微生物菌種保藏中心 (中國，北京)，原核表達(dá)載體pET-28a(+)由本實驗室保存，兔抗LM陽性血清由本實驗室制備，7周齡昆明雄性小鼠購于蘭州獸醫(yī)研究所動物中心，腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)購自北京Solarbio科技有限公司，大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、TMB底物顯色液均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ和T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司；預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑購自Sigma公司(美國)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物均購自O(shè)XOID公司(英國)。其余試劑皆為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中公布的inlG基因序列，設(shè)計inlG基因的特異性引物，其中InlG-F為上游引物，下劃線部是EcoRⅠ的酶切位點。InlG-R為下游引物，下劃線部位是HindⅢ的酶切位點，上游引物序列為：5′-CCGGAATTCATGAAACAGAGAAAAACCTCAGTA-3′；下游引物序列為：5′-CCCAAGCTTTTAAATGTTAGTAGTTTTTTTTCG-3′，擴增片段預(yù)期大小為1 473 bp。引物由金唯智生物公司合成。

1.4 目的基因擴增

將-80 ℃凍存的標(biāo)準(zhǔn)株LM在BHI固體培養(yǎng)基四區(qū)劃線培養(yǎng)，挑取單個菌落培養(yǎng)12～14 h，提取基因組。已提取LM基因組為模板，設(shè)計合成的上游引物InlG-F、下游引物InlG-R擴增基因inlG片段。反應(yīng)體系為：上、下游引物各1 μL、基因組1 μL、ddH2O 9.5 μL、2×PCR Mix 12.5 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用DNA膠回收試劑盒回收inlG基因片段，與pMD19-T在16 ℃過夜連接，后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)，篩選陽性克隆送金唯智生物公司測序。

1.5 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒

將pMD19-T-InlG經(jīng)EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切后回收inlG基因，pET-28a(+)經(jīng)雙酶切后回收，連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)，挑取單個菌落鑒定陽性的重組質(zhì)粒。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

pET-28a(+)-InlG轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，在卡那抗性的LB固體培養(yǎng)板上恒溫培養(yǎng)，挑取單個菌落振蕩培養(yǎng)14～16 h，以一定比例接種于5 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，加入1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h，收集誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況。

1.6.1 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

分3組優(yōu)化表達(dá)條件：將菌液接種到液體培養(yǎng)基中，加入不同濃度誘導(dǎo)劑(0.5、0.7、0.9、1.0和1.2 mmol/L的IPTG)，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h；不同溫度(16、28、30和41 ℃)誘導(dǎo)表達(dá)14 h；不同時間(6、8、10、12和14 h)誘導(dǎo)表達(dá)，分別收集處理誘導(dǎo)并超聲后的樣品。將上清和沉淀樣品處理后經(jīng)SDS-PAGE，分析蛋白表達(dá)形式。

1.6.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化

將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液處理、SDS-PAGE后，考馬斯亮藍(lán)染色，表達(dá)后的蛋白切膠條送往上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定后應(yīng)用Ni-NTA親和純化層析柱純化目的蛋白(操作參照試劑盒說明)，SDS-PAGE分析表達(dá)純化結(jié)果。

1.7 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

經(jīng)SDS-PAGE分離后，切膠移至NC膜上，90 V濕轉(zhuǎn)60 min后，用PBST洗滌NC膜3次后，LM兔陽性血清用PBST按1∶1 000稀釋，將NC膜轉(zhuǎn)移到稀釋好的血清里37 ℃孵育1 h；用PBST洗滌3次后，加入稀釋好的1∶5 000的羊抗兔IgG，于37 ℃放置2 h，最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。以誘導(dǎo)前的全菌作為陰性對照。

1.8 小鼠免疫及攻毒試驗

1.8.1 LM對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)測定

將LM在BHI培養(yǎng)基中劃線，挑取單個菌落培養(yǎng)，測定OD600為1.0時，收集菌體用滅菌生理鹽水洗滌3次后，調(diào)至不同濃度進(jìn)行平板計數(shù)。昆明小鼠60只，6～8周齡均為雌性，隨機分成6組，即：5個劑量組和1個對照組，每組10只。不同濃度菌分別腹腔注射小鼠，每只小鼠注射0.1 mL，感染小鼠菌量分別為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105CFU/只，對照組小鼠注射同等體積滅菌生理鹽水，在注射后不同時間段對小鼠進(jìn)行觀察。通過寇氏法計算LM對小鼠的LD50。

1.8.2 小鼠免疫及抗體效價測定

將7周齡雄性健康小鼠隨機分為試驗組和對照組，每組16只。純化的InlG蛋白定量加弗氏完全佐劑乳化后，以100 μg/只的劑量多點皮下注射試驗組小鼠，每只小鼠注射0.2 mL，對照組注射等體積的生理鹽水，2組小鼠于相同條件下飼喂14 d后，試驗組改為弗氏不完全佐劑加強免疫1次，免疫方法、劑量同第1次免疫；免疫后小鼠斷尾采血，分離血清，檢測效價。以InlG蛋白作為抗原包被于酶標(biāo)板，利用間接ELISA方法檢測小鼠抗體水平。

1.8.3 攻毒試驗

測定效價后，用2 LD50的LM進(jìn)行攻毒，LM經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌3次，制備成菌懸液后腹腔注射給小鼠，觀察記錄小鼠精神狀態(tài)，統(tǒng)計各組小鼠的存活率。

2 結(jié)果

2.1 inlG基因的擴增

瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物大小為1 473 bp，與預(yù)期相符(圖1)。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. inlG基因；2.陰性對照

2.2 重組表達(dá)載體的鑒定

重組表達(dá)載體pET-28a(+)-InlG經(jīng)EcoRⅠ與Hind Ⅲ雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳分析得到，雙酶切后有約5 400 bp的載體條帶和1 473 bp的目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-28a(+)-InlG；2. pET-28a(+)-InlG的雙酶切產(chǎn)物；3. inlG基因

2.3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，收集處理菌體，經(jīng)SDS-PAGE，在70 ku處有蛋白條帶，誘導(dǎo)前的pET-28a-InlG菌液處理后未出現(xiàn)蛋白條帶。pET-28a-InlG優(yōu)化表達(dá)條件后，經(jīng)SDS-PAGE分析(圖3)，IPTG終濃度為1.0 mmol/L時，37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后，表達(dá)量較高，表達(dá)產(chǎn)物主要為可溶性蛋白。

M. 預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-28a-InlG誘導(dǎo)前全菌；2. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后全菌；3. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后上清；4. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后沉淀；5. 純化后的重組蛋白

預(yù)測InlG蛋白分子量約為53 ku，但經(jīng)SDS-PAGE可見大小約70 ku，與理論預(yù)期不符。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白切膠條質(zhì)譜鑒定結(jié)果與LM參考序列比對，其覆蓋度和得分都比較高，肽段覆蓋率可達(dá)79%，可進(jìn)行下一步試驗。

2.4 重組蛋白的反應(yīng)原性分析

以LM陽性血清為一抗，羊抗兔IgG為二抗，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后蛋白與LM陽性血清反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶，未誘導(dǎo)的全菌未出現(xiàn)條帶(圖4)，說明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. pET-28a-InlG誘導(dǎo)前全菌；2. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后全菌

2.5 單增李斯特菌的LD50測定

不同劑量LM菌液注射小鼠后，根據(jù)每組小鼠死亡數(shù)計算死亡率(表1)，根據(jù)寇氏法計算出LM的LD50為1.0×106.6CFU。

表1 小鼠半數(shù)致死量測定

2.6 小鼠攻毒試驗

InlG重組蛋白為包被抗原，間接ELISA檢測InlG蛋白免疫小鼠的抗體效價可達(dá)1∶52 000以上。LM腹腔感染小鼠后，對照組小鼠被毛粗糙、扎堆、精神萎靡，個別小鼠逐漸出現(xiàn)顫栗、眼角分泌物增多、呼吸頻率加快和耳朵出血癥狀，15只小鼠72 h內(nèi)陸續(xù)死亡，1只小鼠存活，存活率為6.25%。試驗組中8只小鼠出現(xiàn)相似癥狀并陸續(xù)死亡，另外8只小鼠于攻毒后48 h開始恢復(fù)正常并存活下來，存活率為50%。

3 討論

LM是重要的食源性人獸共患病原菌，其致病性與毒力因子相關(guān)。LM可穿越感染宿主的3道屏障，即腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障，感染過程與多種毒力因子和酶有關(guān)，如：內(nèi)化素、p60蛋白、表面蛋白p104、纖連蛋白結(jié)合蛋白A、酰胺酶(Ami)、自溶素(Auto)等[22]。因此，研究與LM內(nèi)化素相關(guān)毒力因子，對了解LM的致病原理和李斯特菌病的防治具有重要意義。

inlG基因編碼490個氨基酸，預(yù)測分子量約為53 ku，經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)InlG蛋白約為70 ku，與預(yù)期相差17 ku，但I(xiàn)nlG蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定后，質(zhì)譜結(jié)果與LM參考序列覆蓋度和得分都比較高。蛋白質(zhì)電泳結(jié)果大小和預(yù)測值存在偏差，分析可能與預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在不同濃度SDS-PAGE條件下蛋白分離的效率有關(guān)。蛋白經(jīng)水煮變性處理后會形成棒狀結(jié)構(gòu)，表面均勻吸附離子，大小不同的蛋白形成相應(yīng)的“棒狀”體，SDS-PAGE時通過分子篩和電荷效應(yīng)被分離。實際上，不同的蛋白由于氨基酸組成等原因，并不符合這一基本假設(shè)，因此有時會出現(xiàn)如上偏差。

用2 LD50的LM(1×108CFU)活菌腹腔感染小鼠，試驗組16只小鼠死亡8只。分析小鼠死亡原因，試驗中LM菌株是致病性較強的1/2a血清型，另外也可能與InlG蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的保護力不夠有關(guān)。本試驗只選取內(nèi)化素家族的單個InlG進(jìn)行免疫保護性研究試驗。吳金花等[23]構(gòu)建了奶牛乳腺炎無乳鏈球菌sip、pgk及fbsA基因主要抗原區(qū)域的融合表達(dá)，融合表達(dá)蛋白可具備Sip、Pgk及FbsA蛋白的三重活性，而且在小鼠的攻毒保護性試驗中，重組融合抗原對攻毒小鼠的保護優(yōu)于單個蛋白。姜秀云等[24]研究發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌mpb51與mpb70基因融合一起，純化的融合蛋白比單一蛋白具有更高的抗原反應(yīng)性。下一步可將內(nèi)化素家族具有優(yōu)勢抗原表位的基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá)，研究串聯(lián)基因表達(dá)的蛋白是否具有良好的抗原性。雖然InlG蛋白具有一定的抗原保護性，但在本試驗中未與其他內(nèi)化素(InlA和InlB等)的保護性進(jìn)行比較，InlG蛋白是否有黏附、侵襲等特性還有待進(jìn)一步研究。

綜上，本研究成功表達(dá)出LM的InlG蛋白，該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。重組蛋白制備成亞單位疫苗免疫小鼠，小鼠能產(chǎn)生較高滴度的抗體，表明InlG蛋白具有良好的免疫原性，且對小鼠有一定的免疫保護性。研究結(jié)果為探討inlG基因生物學(xué)功能和李氏桿菌病的防控奠定基礎(chǔ)。