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        單增李斯特菌內(nèi)化素基因inlG基因原核表達(dá)及小鼠免疫保護(hù)性分析

        2021-09-06 05:27:44劉圓園曹啟航孫亞楠委慧玲薛惠文茍惠天
        畜牧與獸醫(yī) 2021年9期
        關(guān)鍵詞:內(nèi)化試劑盒引物

        劉圓園,曹啟航,孫亞楠,委慧玲,薛惠文,茍惠天

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070)

        單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,簡稱LM)也稱單增李斯特菌,是一種重要的人畜共患病原菌,它主要以食物為傳播媒介,是最致命的食源性病原體之一,其致死率高達(dá)30%[1-2],對人類安全構(gòu)成很大威脅。研究顯示,已有16種血清型被鑒定出來,主要有3種血清型常見于感染中,分別是譜系Ⅰ中4b型、1/2b型以及譜系Ⅱ中1/2a型菌株[3-4]。LM作為一種胞內(nèi)寄生菌,能刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答,并誘導(dǎo)CD8+T和CD4+T特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。CD8+T 細(xì)胞可分泌穿孔素、顆粒酶及釋放γ干擾素(IFN-γ),CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Th1 細(xì)胞因子[5-6]。人主要通過糞-口途徑感染李斯特菌,同時(shí)通過眼睛、黏膜和破損的皮膚也可感染[7-8]。LM入侵宿主細(xì)胞的過程極其復(fù)雜,涉及致病因子、黏附分子、內(nèi)化素等多種蛋白分子[9]。

        內(nèi)化素(internalin,Inl)是LM中一個(gè)由基因編碼的蛋白家族。目前己知有25種內(nèi)化素,其中InlA和InlB為最早鑒定出的與細(xì)菌侵襲相關(guān)的內(nèi)化素蛋白[10]。它們與LM毒力有著密切的關(guān)系,是參與細(xì)菌入侵宿主細(xì)胞的主要因子,其功能是對宿主的黏附、侵襲作用[11]。InlA通過與宿主的特異性受體E-cad相互作用來介導(dǎo)LM內(nèi)化入上皮細(xì)胞內(nèi),使LM內(nèi)吞而進(jìn)入宿主的上皮細(xì)胞[12-13]。InlB可以與宿主細(xì)胞表面多種受體作用介導(dǎo)LM黏附、侵襲肝細(xì)胞及非吞噬細(xì)胞[14]。目前,研究表明僅有部分內(nèi)化素在介導(dǎo)LM入侵時(shí)起作用[15-17]。Balandyte等[18]研究發(fā)現(xiàn),InlG蛋白主要存在于環(huán)境分離菌株中,很少存在于LM臨床分離的人和動(dòng)物源菌株中,表明InlG在LM適應(yīng)宿主外環(huán)境和生存息息相關(guān);InlG屬于大分子量的內(nèi)化素,C端是含有LPXTG 結(jié)構(gòu)的內(nèi)化素,通過碳末端與細(xì)菌細(xì)胞壁相連,其基因的表達(dá)不受prfA的控制。有研究結(jié)果顯示InlGHE基因簇的缺失導(dǎo)致對小鼠肝臟和脾臟的定植能力降低,細(xì)菌毒力顯著性下降,表明基因簇與細(xì)菌致病力相關(guān)[19]。蔣建軍[20]從133株單增李斯特菌分離株中研究發(fā)現(xiàn)InlG在譜系Ⅰ中不存在,譜系Ⅱ、Ⅲ中分別為74.2%和30.7%。胡楊峰[21]從分離的236株單增李斯特菌中發(fā)現(xiàn)inlG基因占41.1%。關(guān)于inlG基因在LM的致病力方面的研究較少,其功能需要進(jìn)一步驗(yàn)證。因此,本試驗(yàn)以LM為材料,克隆inlG基因后進(jìn)行測序比對,構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒,誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,并免疫小鼠后以LM攻毒,評價(jià)免疫效果,旨在為進(jìn)一步研究inlG基因功能奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 菌株、培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及血清

        LM標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC19111(禽源)購于中國普通微生物菌種保藏中心 (中國,北京),原核表達(dá)載體pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存,兔抗LM陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備,7周齡昆明雄性小鼠購于蘭州獸醫(yī)研究所動(dòng)物中心,腦心浸出液肉湯培養(yǎng)基(BHI)購自北京Solarbio科技有限公司,大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

        1.2 主要試劑

        細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Marker、TMB底物顯色液均購自天根生化科技(北京)有限公司;pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ和T4 DNA Ligase均購自TaKaRa公司;預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司;弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑購自Sigma公司(美國);超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、BCA蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司;胰蛋白胨和酵母提取物均購自O(shè)XOID公司(英國)。其余試劑皆為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

        1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

        參照GenBank中公布的inlG基因序列,設(shè)計(jì)inlG基因的特異性引物,其中InlG-F為上游引物,下劃線部是EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。InlG-R為下游引物,下劃線部位是HindⅢ的酶切位點(diǎn),上游引物序列為:5′-CCGGAATTCATGAAACAGAGAAAAACCTCAGTA-3′;下游引物序列為:5′-CCCAAGCTTTTAAATGTTAGTAGTTTTTTTTCG-3′,擴(kuò)增片段預(yù)期大小為1 473 bp。引物由金唯智生物公司合成。

        1.4 目的基因擴(kuò)增

        將-80 ℃凍存的標(biāo)準(zhǔn)株LM在BHI固體培養(yǎng)基四區(qū)劃線培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落培養(yǎng)12~14 h,提取基因組。已提取LM基因組為模板,設(shè)計(jì)合成的上游引物InlG-F、下游引物InlG-R擴(kuò)增基因inlG片段。反應(yīng)體系為:上、下游引物各1 μL、基因組1 μL、ddH2O 9.5 μL、2×PCR Mix 12.5 μL,總體積25 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃最終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用DNA膠回收試劑盒回收inlG基因片段,與pMD19-T在16 ℃過夜連接,后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng),篩選陽性克隆送金唯智生物公司測序。

        1.5 構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒

        將pMD19-T-InlG經(jīng)EcoRⅠ與HindⅢ雙酶切后回收inlG基因,pET-28a(+)經(jīng)雙酶切后回收,連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落鑒定陽性的重組質(zhì)粒。

        1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

        pET-28a(+)-InlG轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,在卡那抗性的LB固體培養(yǎng)板上恒溫培養(yǎng),挑取單個(gè)菌落振蕩培養(yǎng)14~16 h,以一定比例接種于5 mL液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8時(shí),加入1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h,收集誘導(dǎo)后的菌液經(jīng)SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況。

        1.6.1 重組蛋白表達(dá)條件優(yōu)化

        分3組優(yōu)化表達(dá)條件:將菌液接種到液體培養(yǎng)基中,加入不同濃度誘導(dǎo)劑(0.5、0.7、0.9、1.0和1.2 mmol/L的IPTG),37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h;不同溫度(16、28、30和41 ℃)誘導(dǎo)表達(dá)14 h;不同時(shí)間(6、8、10、12和14 h)誘導(dǎo)表達(dá),分別收集處理誘導(dǎo)并超聲后的樣品。將上清和沉淀樣品處理后經(jīng)SDS-PAGE,分析蛋白表達(dá)形式。

        1.6.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化

        將誘導(dǎo)表達(dá)后的菌液處理、SDS-PAGE后,考馬斯亮藍(lán)染色,表達(dá)后的蛋白切膠條送往上海鹿明生物科技有限公司進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。質(zhì)譜鑒定后應(yīng)用Ni-NTA親和純化層析柱純化目的蛋白(操作參照試劑盒說明),SDS-PAGE分析表達(dá)純化結(jié)果。

        1.7 表達(dá)產(chǎn)物的Western blot鑒定

        經(jīng)SDS-PAGE分離后,切膠移至NC膜上,90 V濕轉(zhuǎn)60 min后,用PBST洗滌NC膜3次后,LM兔陽性血清用PBST按1∶1 000稀釋,將NC膜轉(zhuǎn)移到稀釋好的血清里37 ℃孵育1 h;用PBST洗滌3次后,加入稀釋好的1∶5 000的羊抗兔IgG,于37 ℃放置2 h,最后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色。以誘導(dǎo)前的全菌作為陰性對照。

        1.8 小鼠免疫及攻毒試驗(yàn)

        1.8.1 LM對小鼠的半數(shù)致死量(LD50)測定

        將LM在BHI培養(yǎng)基中劃線,挑取單個(gè)菌落培養(yǎng),測定OD600為1.0時(shí),收集菌體用滅菌生理鹽水洗滌3次后,調(diào)至不同濃度進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。昆明小鼠60只,6~8周齡均為雌性,隨機(jī)分成6組,即:5個(gè)劑量組和1個(gè)對照組,每組10只。不同濃度菌分別腹腔注射小鼠,每只小鼠注射0.1 mL,感染小鼠菌量分別為1.0×109、1.0×108、1.0×107、1.0×106和1.0×105CFU/只,對照組小鼠注射同等體積滅菌生理鹽水,在注射后不同時(shí)間段對小鼠進(jìn)行觀察。通過寇氏法計(jì)算LM對小鼠的LD50。

        1.8.2 小鼠免疫及抗體效價(jià)測定

        將7周齡雄性健康小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對照組,每組16只。純化的InlG蛋白定量加弗氏完全佐劑乳化后,以100 μg/只的劑量多點(diǎn)皮下注射試驗(yàn)組小鼠,每只小鼠注射0.2 mL,對照組注射等體積的生理鹽水,2組小鼠于相同條件下飼喂14 d后,試驗(yàn)組改為弗氏不完全佐劑加強(qiáng)免疫1次,免疫方法、劑量同第1次免疫;免疫后小鼠斷尾采血,分離血清,檢測效價(jià)。以InlG蛋白作為抗原包被于酶標(biāo)板,利用間接ELISA方法檢測小鼠抗體水平。

        1.8.3 攻毒試驗(yàn)

        測定效價(jià)后,用2 LD50的LM進(jìn)行攻毒,LM經(jīng)滅菌生理鹽水洗滌3次,制備成菌懸液后腹腔注射給小鼠,觀察記錄小鼠精神狀態(tài),統(tǒng)計(jì)各組小鼠的存活率。

        2 結(jié)果

        2.1 inlG基因的擴(kuò)增

        瓊脂糖凝膠電泳檢測,PCR產(chǎn)物大小為1 473 bp,與預(yù)期相符(圖1)。

        M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. inlG基因;2.陰性對照

        2.2 重組表達(dá)載體的鑒定

        重組表達(dá)載體pET-28a(+)-InlG經(jīng)EcoRⅠ與Hind Ⅲ雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳分析得到,雙酶切后有約5 400 bp的載體條帶和1 473 bp的目的條帶,大小與預(yù)期結(jié)果相符(圖2)。

        M. DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET-28a(+)-InlG;2. pET-28a(+)-InlG的雙酶切產(chǎn)物;3. inlG基因

        2.3 重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

        經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,收集處理菌體,經(jīng)SDS-PAGE,在70 ku處有蛋白條帶,誘導(dǎo)前的pET-28a-InlG菌液處理后未出現(xiàn)蛋白條帶。pET-28a-InlG優(yōu)化表達(dá)條件后,經(jīng)SDS-PAGE分析(圖3),IPTG終濃度為1.0 mmol/L時(shí),37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h后,表達(dá)量較高,表達(dá)產(chǎn)物主要為可溶性蛋白。

        M. 預(yù)染蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET-28a-InlG誘導(dǎo)前全菌;2. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后全菌;3. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后上清;4. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后沉淀;5. 純化后的重組蛋白

        預(yù)測InlG蛋白分子量約為53 ku,但經(jīng)SDS-PAGE可見大小約70 ku,與理論預(yù)期不符。誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白切膠條質(zhì)譜鑒定結(jié)果與LM參考序列比對,其覆蓋度和得分都比較高,肽段覆蓋率可達(dá)79%,可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

        2.4 重組蛋白的反應(yīng)原性分析

        以LM陽性血清為一抗,羊抗兔IgG為二抗,結(jié)果顯示誘導(dǎo)后蛋白與LM陽性血清反應(yīng)出現(xiàn)特異性條帶,未誘導(dǎo)的全菌未出現(xiàn)條帶(圖4),說明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

        M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1. pET-28a-InlG誘導(dǎo)前全菌;2. pET-28a-InlG誘導(dǎo)后全菌

        2.5 單增李斯特菌的LD50測定

        不同劑量LM菌液注射小鼠后,根據(jù)每組小鼠死亡數(shù)計(jì)算死亡率(表1),根據(jù)寇氏法計(jì)算出LM的LD50為1.0×106.6CFU。

        表1 小鼠半數(shù)致死量測定

        2.6 小鼠攻毒試驗(yàn)

        InlG重組蛋白為包被抗原,間接ELISA檢測InlG蛋白免疫小鼠的抗體效價(jià)可達(dá)1∶52 000以上。LM腹腔感染小鼠后,對照組小鼠被毛粗糙、扎堆、精神萎靡,個(gè)別小鼠逐漸出現(xiàn)顫栗、眼角分泌物增多、呼吸頻率加快和耳朵出血癥狀,15只小鼠72 h內(nèi)陸續(xù)死亡,1只小鼠存活,存活率為6.25%。試驗(yàn)組中8只小鼠出現(xiàn)相似癥狀并陸續(xù)死亡,另外8只小鼠于攻毒后48 h開始恢復(fù)正常并存活下來,存活率為50%。

        3 討論

        LM是重要的食源性人獸共患病原菌,其致病性與毒力因子相關(guān)。LM可穿越感染宿主的3道屏障,即腸道屏障、血腦屏障和胎盤屏障,感染過程與多種毒力因子和酶有關(guān),如:內(nèi)化素、p60蛋白、表面蛋白p104、纖連蛋白結(jié)合蛋白A、酰胺酶(Ami)、自溶素(Auto)等[22]。因此,研究與LM內(nèi)化素相關(guān)毒力因子,對了解LM的致病原理和李斯特菌病的防治具有重要意義。

        inlG基因編碼490個(gè)氨基酸,預(yù)測分子量約為53 ku,經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)InlG蛋白約為70 ku,與預(yù)期相差17 ku,但I(xiàn)nlG蛋白經(jīng)質(zhì)譜鑒定后,質(zhì)譜結(jié)果與LM參考序列覆蓋度和得分都比較高。蛋白質(zhì)電泳結(jié)果大小和預(yù)測值存在偏差,分析可能與預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)在不同濃度SDS-PAGE條件下蛋白分離的效率有關(guān)。蛋白經(jīng)水煮變性處理后會形成棒狀結(jié)構(gòu),表面均勻吸附離子,大小不同的蛋白形成相應(yīng)的“棒狀”體,SDS-PAGE時(shí)通過分子篩和電荷效應(yīng)被分離。實(shí)際上,不同的蛋白由于氨基酸組成等原因,并不符合這一基本假設(shè),因此有時(shí)會出現(xiàn)如上偏差。

        用2 LD50的LM(1×108CFU)活菌腹腔感染小鼠,試驗(yàn)組16只小鼠死亡8只。分析小鼠死亡原因,試驗(yàn)中LM菌株是致病性較強(qiáng)的1/2a血清型,另外也可能與InlG蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的保護(hù)力不夠有關(guān)。本試驗(yàn)只選取內(nèi)化素家族的單個(gè)InlG進(jìn)行免疫保護(hù)性研究試驗(yàn)。吳金花等[23]構(gòu)建了奶牛乳腺炎無乳鏈球菌sip、pgk及fbsA基因主要抗原區(qū)域的融合表達(dá),融合表達(dá)蛋白可具備Sip、Pgk及FbsA蛋白的三重活性,而且在小鼠的攻毒保護(hù)性試驗(yàn)中,重組融合抗原對攻毒小鼠的保護(hù)優(yōu)于單個(gè)蛋白。姜秀云等[24]研究發(fā)現(xiàn)牛分枝桿菌mpb51與mpb70基因融合一起,純化的融合蛋白比單一蛋白具有更高的抗原反應(yīng)性。下一步可將內(nèi)化素家族具有優(yōu)勢抗原表位的基因進(jìn)行串聯(lián)表達(dá),研究串聯(lián)基因表達(dá)的蛋白是否具有良好的抗原性。雖然InlG蛋白具有一定的抗原保護(hù)性,但在本試驗(yàn)中未與其他內(nèi)化素(InlA和InlB等)的保護(hù)性進(jìn)行比較,InlG蛋白是否有黏附、侵襲等特性還有待進(jìn)一步研究。

        綜上,本研究成功表達(dá)出LM的InlG蛋白,該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。重組蛋白制備成亞單位疫苗免疫小鼠,小鼠能產(chǎn)生較高滴度的抗體,表明InlG蛋白具有良好的免疫原性,且對小鼠有一定的免疫保護(hù)性。研究結(jié)果為探討inlG基因生物學(xué)功能和李氏桿菌病的防控奠定基礎(chǔ)。

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