繆穎雪，楊大偉，苗晉鋒，郭凡溪，毛寧，余祖功*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210095;2. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

大腸桿菌是奶牛乳房炎的主要病原菌之一，發(fā)病率高，危害嚴(yán)重[1]。大腸桿菌能通過黏附在生物或非生物表面進(jìn)行細(xì)胞分裂、定植形成生物被膜，增強(qiáng)對宿主免疫系統(tǒng)和抗菌藥物的耐受性，據(jù)報(bào)道生物被膜中的細(xì)菌對抗菌藥的耐受性往往是浮游菌的10到1 000倍[2]。也有報(bào)道大腸桿菌能入侵奶牛乳腺上皮細(xì)胞，引起持續(xù)的乳腺內(nèi)感染，增加乳房炎防治難度[3]。

利福昔明(rifaximin, RIF)是利福霉素類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)等特點(diǎn)，已被批準(zhǔn)于干奶期和泌乳期應(yīng)用防治奶牛乳房炎[4]。精油具有抗菌、抗病毒、抗炎等多種藥理作用[5]，近年因其具有抗生物被膜和抑殺固著微生物的特點(diǎn)，使其在食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)越來越受重視。Goldbeck等[6]發(fā)現(xiàn)桉葉油能有效抑制變形鏈球菌形成生物被膜；黃衛(wèi)峰等[7]研究發(fā)現(xiàn)魚腥草素能抑制銅綠假單胞菌形成生物被膜，并能影響其群體感應(yīng)信號(hào)分子高絲氨酸內(nèi)酯的分泌；也有研究發(fā)現(xiàn)薄荷油能抑制鏈球菌生物被膜的形成[8]。精油與抗菌藥物聯(lián)用不僅有協(xié)同抗菌效果，還能通過阻抑生物被膜而減少細(xì)菌對抗菌藥物的耐受性。消毒液中添加薄荷醇和檸檬精油后，消毒效果增強(qiáng)的同時(shí)還可阻止沙門菌在塑料表面上形成生物被膜[9]。

利福昔明與精油聯(lián)用是否能夠增強(qiáng)抗菌和抗生物被膜效果，值得關(guān)注。因此本試驗(yàn)測定了利福昔明與精油(桉葉油、薄荷油、魚腥草油)單獨(dú)或聯(lián)合使用對奶牛乳房炎源大腸桿菌的體外抑菌作用、對大腸桿菌形成生物被膜的干預(yù)作用及對成熟生物被膜的消除作用，為精油在抗生物被膜感染方面的開發(fā)應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

RIF對照品，購自中國食品藥品檢定研究院；精油(essential oils，EOs)：桉葉油(eucalyptus essential oil, EEO)、薄荷油(mint essential oil, MEO)、魚腥草油(houttuynia essential oil, HEO)購自吉水縣水南威霸香料有限公司；氨芐西林、阿莫西林、芐星鄰氯、卡那霉素、林可霉素、頭孢氨芐、頭孢噻呋和頭孢喹肟購自華北制藥集團(tuán)；水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基(MHB)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

大腸桿菌質(zhì)控株ATCC25922購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所, 47株大腸桿菌臨床分離株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)藥理組從乳房炎源牛奶樣中分離、鑒定并保存。

1.2 藥品儲(chǔ)備液和菌液配制

RIF溶液的配制：精密稱取RIF適量，用甲醇溶解配成濃度為1 280 μg/mL的藥液，過濾分裝后保存于-20 ℃冰箱。

精油溶液的配制：精油和吐溫-80以1∶1的體積比例溶解，得到50%的精油溶液，過濾分裝后，于4 ℃保存。

菌液：大腸桿菌接種于TSB培養(yǎng)基中，置37 ℃搖床孵育8～10 h至對數(shù)中期，用MHB稀釋得到濃度約為1×108CFU/mL的菌液(酶標(biāo)儀測量OD600 nm=0.1)備用。

1.3 大腸桿菌生物被膜形成能力的測定

根據(jù)Ikram等[10]的方法并加以改進(jìn)，測定47株大腸桿菌臨床株被膜形成能力。將菌液用TSB-g(含1%葡萄糖的TSB)稀釋至107CFU/mL，測定其生物被膜在48 h時(shí)的形成量。對96孔板底經(jīng)0.1%的結(jié)晶紫染色后的生物被膜用水漂洗3次后，加入200 μL無水乙醇脫色，并用酶標(biāo)儀測量595 nm處的吸光度(OD595 nm)，無菌的空白孔同樣染色作為陰性對照。采用Yang等[11]的標(biāo)準(zhǔn)用光學(xué)密度截止值(ODc)對結(jié)果進(jìn)行劃分。ODc高于陰性對照的光密度(OD)平均值的3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，即：ODc=陰性對照的平均OD+(3×陰性對照的SD)。根據(jù)其光密度將結(jié)果分為4類：強(qiáng)成膜株(4ODc

1.4 最小抑菌濃度和最小殺菌濃度的測定

根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)制定的微量肉湯稀釋法[12]測定RIF、批準(zhǔn)經(jīng)乳房注入的乳房炎常用抗生素和精油對47株臨床株和質(zhì)控株的最小抑菌濃度(MIC)，以2倍稀釋法于96孔板中用MHB稀釋藥液使1～11列皆含100 μL藥液，再加入用MHB稀釋至1×106CFU/mL的菌液各100 μL至前11列，第12列前4孔加入200 μL MHB，后4孔加入200 μL菌液。于37 ℃溫箱培養(yǎng)16～20 h后，肉眼觀察試驗(yàn)孔清澈無菌生長的最小藥物濃度為MIC。MIC50為能抑制50%的菌株生長的最低藥物濃度，MIC90為能抑制90%的菌株生長的最低藥物濃度。根據(jù)Hendry等[13]的方法測定最小殺菌濃度(MBC)，96孔板的無菌生長孔中每孔取50 μL菌液涂布于MH平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后，無菌落生長的平板所對應(yīng)的最低藥物濃度為MBC。

1.5 聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

選擇質(zhì)控株和19株成膜能力不同的臨床株，其中：弱成膜1株(QM1)、中等成膜4株(E31、DS1、DS2、QM2)和強(qiáng)成膜14株(E1、E26、E27、E28、E29、E30、E32、E33、LN1、LN2、NMG1、NMG2、QTX1、QTX2)，根據(jù)Buldain等[4]的方法，采用棋盤稀釋法測定RIF和精油的聯(lián)合抑菌指數(shù)(FICI), FICI=MICA藥聯(lián)合/MICA藥單獨(dú)+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單獨(dú)。結(jié)果判斷:FICI≤0.5為協(xié)同；0.52為拮抗。

1.6 最小抑膜濃度的測定

選擇與聯(lián)合抑菌試驗(yàn)相同的19株臨床株，根據(jù)Huang等[14]的方法加以改進(jìn)，測定RIF和精油對大腸桿菌的最小抑制被膜濃度(MBIC)。在96孔板中加入稀釋后的菌液和藥液，使得96孔板中菌液(107CFU/mL)含藥終濃度為1 MIC～16 MIC，培養(yǎng)板置于37 ℃培養(yǎng)48 h。染色步驟與被膜形成能力測定試驗(yàn)相同。MBIC為與陰性對照OD595nm相同的最小濃度。

1.7 RIF、EEO對被膜形成抑制作用和預(yù)制被膜消除作用的測定

選擇5株強(qiáng)成膜株(E1、E26、E28、NMG1和NMG2)，根據(jù)Federman等[15]的方法稍加改進(jìn)，分別用1/2 MIC的RIF，不同濃度(0、1/2、1/4、1/8和1/16 MIC)的EEO以及上述濃度EEO聯(lián)合RIF處理大腸桿菌，用結(jié)晶紫染色法測定藥物對于被膜形成抑制作用和對預(yù)制被膜消除作用，以無藥處理組作為對照組。其中測定對被膜形成影響的試驗(yàn)在37 ℃培養(yǎng)48 h；測定對預(yù)先形成的被膜(預(yù)制被膜)影響的試驗(yàn)中使被膜在37 ℃預(yù)生長48 h。結(jié)果表示為被膜形成率(或被膜留存率)。被膜形成率(或被膜留存率)=OD595 nm處理組/OD595 nm對照組×100%。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析由SPSS 19.0進(jìn)行，采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)差異。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌被膜形成能力

47株大腸桿菌臨床株在48 h時(shí)的被膜形成情況如圖1所示。其中有7株菌OD值在0.114～0.228，為弱成膜株；12株菌OD值在0.228～0.458，為中等成膜株；28株菌OD值>0.458，為強(qiáng)成膜株。強(qiáng)成膜株占總數(shù)一半以上。

圖1 47株大腸桿菌在48 h時(shí)的生物被膜形成量

2.2 RIF和精油對浮游菌的抑制作用

RIF、乳房炎常用抗生素和3種精油對47株大腸桿菌臨床分離株及質(zhì)控株的MIC見表1。其中CLSI規(guī)定氨芐西林和阿莫西林的耐藥折點(diǎn)為16 μg/mL，耐藥率分別為59.57%和63.83%；頭孢噻呋的耐藥折點(diǎn)為4 μg/mL，耐藥率為25.53%，另幾種的耐藥折點(diǎn)暫未列出。而RIF相較于林可霉素、氨芐西林、芐星鄰氯、頭孢氨芐、阿莫西林都有更小的MIC50和MIC90值；RIF與卡那霉素、頭孢噻呋、頭孢喹肟相比雖然MIC50更高，但MIC90值遠(yuǎn)小于這幾種藥；且RIF的MIC范圍相對較低較窄。綜合比較，RIF對臨床株浮游菌的抗菌活性優(yōu)于另幾種抗生素。RIF對大腸桿菌的MIC值為1～128 μg/mL，EEO對大腸桿菌的MIC值為0.16%～2.5%，MEO對大腸桿菌的MIC值為0.04%～0.63%，HEO對大腸桿菌MIC值為0.04%～1.25%。其中RIF和EEO的MIC90皆為其MIC50的4倍，MEO和HEO的MIC90為其MIC50的2倍。3種精油中MEO的抑菌作用最強(qiáng)，HEO稍弱，EEO最次。

表1 乳房炎常用抗生素和3種精油對大腸桿菌的MIC和MBC(n=48)

RIF和精油對大腸桿菌的MBC結(jié)果以MBC范圍及MBC/MIC比值表示，比值分布見表2。RIF對大腸桿菌的MBC/MIC比值為1的有27株菌，為2的有17株菌，為4～8的有4株。EEO對大腸桿菌在3種精油中MBC/MIC比值為1的菌株最少，為16株菌，MEO和HEO分別為36和37株；EEO該比值為2的菌株為26株，多于MEO的8株和HEO的11株；EEO該比值為4的菌株為6株，也多于MEO的4株和HEO的0株。3種精油中MEO和HEO的殺菌活性水平相似，都稍高于EEO。RIF也有一定的殺菌活性，但稍弱于精油。

表2 RIF和3種精油對大腸桿菌的MBC/MIC比值分布(n=48)

2.3 RIF聯(lián)合精油對浮游菌的抑菌作用

RIF和3種精油對19株臨床分離大腸桿菌和質(zhì)控株的聯(lián)合抑菌效果見表3。RIF+EEO對4株菌為無關(guān)作用，對15株菌為相加，對1株菌為協(xié)同，相加或協(xié)同效果占受試菌株的80%；而RIF+MEO和RIF+HEO都對8株菌為無關(guān)作用，對11株菌為相加，對1株菌為協(xié)同，相加或協(xié)同效果占受試菌株60%。所以RIF+EEO在這3種組合中對大腸桿菌浮游菌的聯(lián)合抑菌效果最好。

表3 RIF和3種精油的組合對大腸桿菌的聯(lián)合抑菌效果(n=20)

2.4 RIF和精油對大腸桿菌的MBIC

RIF和3種精油對19株臨床分離大腸桿菌的MBIC結(jié)果以MBIC/MIC比值分布表示，比值越低，則抗被膜活性越好。結(jié)果見表4，MBIC/MIC比值在1～16不等，84%以上的菌株為1～4。其中RIF對58%的臨床株MBIC/MIC比值為1～2，且有1株菌比值為16；EEO對74%的臨床株MBIC/MIC比值為1～2；MEO對78%的臨床株MBIC/MIC比值為1～2；HEO對32%的臨床株MBIC/MIC比值為1～2。與抑制浮游菌活性相比，3種精油中HEO的抑膜效果最差，EEO與MEO相似，而RIF的抑膜效果也弱于精油。

表4 RIF和3種精油對大腸桿菌的MBIC/MIC比值分布(n=19)

2.5 RIF、EEO單獨(dú)及聯(lián)合對被膜形成的抑制作用

亞抑菌濃度的EEO與1/2 MIC的RIF單獨(dú)或聯(lián)合對5株強(qiáng)成膜的大腸桿菌的被膜形成時(shí)影響如圖2所示。與對照組相比，RIF單獨(dú)使用對5株菌都有極顯著抑制被膜形成的效果(P<0.01)，被膜形成率在43.8%～77.9%。與對照組相比，不同濃度EEO的單獨(dú)使用對5株菌的被膜形成大多有極顯著抑制的作用(P<0.01)，如當(dāng)EEO濃度為1/2 MIC～1/16 MIC，NMG1形成率為11.3%～27.2%，NMG2形成率為5.8%～19.8%，E28形成率為67.1%～92.7%；但在EEO濃度為低濃度(1/8 MIC～1/16 MIC)時(shí)，對E1,E26被膜形成無顯著影響。RIF與不同濃度EEO聯(lián)合使用時(shí)，5株菌與對照組相比皆有極顯著抑制作用(P<0.01)；與RIF組相比，除E28在RIF聯(lián)合1/4 MIC濃度EEO時(shí)無差異，對5株菌的被膜形成皆有極顯著抑制作用(P<0.01)，形成率6.9%～41.7%。即RIF單獨(dú)使用、EEO單獨(dú)使用和RIF+EEO都對大腸桿菌被膜形成有很好的抑制作用，且聯(lián)合使用時(shí)效果優(yōu)于單藥。

2.6 RIF、EEO單獨(dú)及聯(lián)合對預(yù)制被膜的消除作用

亞抑菌濃度的EEO與1/2 MIC的RIF單獨(dú)或聯(lián)合對5株強(qiáng)成膜的大腸桿菌的預(yù)制被膜的影響如圖3所示。RIF單獨(dú)使用與對照組相比，除對NMG1無顯著影響，對另外4株菌都有極顯著消除預(yù)制被膜的效果(P<0.01)，被膜留存率56.6%～85%。高濃度EEO的單獨(dú)使用與對照組相比對大部分大腸桿菌預(yù)制被膜有消除作用(P<0.01)，如當(dāng)EEO濃度為1/2 MIC～1/8 MIC，E1留存率為44.8%～87.1%，E26留存率為59.5%～75.7%；在EEO濃度是1/2 MIC～1/4 MIC時(shí)，E28留存率為69.2%～81.1%；EEO濃度為1/2 MIC時(shí)，NMG1留存率為77.6%；但1/2 MIC～1/16 MIC的EEO都對NMG2的預(yù)制被膜無顯著影響。RIF與不同濃度EEO聯(lián)合使用時(shí)，與對照組相比5株菌的預(yù)制被膜皆被顯著消除(P<0.05)。但與RIF組相比，僅含高濃度EEO的聯(lián)用組對部分菌株預(yù)制被膜有顯著影響(P<0.01)，當(dāng)1/2 MIC～1/8 MIC的EEO聯(lián)合RIF時(shí)，E1留存率為57%～61.6%，NMG2留存率為54.3%～64.7%；而1/2 MIC～1/16 MIC的EEO聯(lián)合RIF都對E26和E28預(yù)制被膜無顯著作用。對于預(yù)制被膜，RIF+EEO的消除效果明顯好于RIF或EEO單獨(dú)使用。

注：對照組為無藥組(1/2 MIC RIF且EEO濃度為0)，RIF組為單獨(dú)使用1/2 MIC RIF(即0 MIC EEO+1/2 MIC RIF)。與對照組相比,*P<0.05，**P<0.01，與RIF組相比,#P<0.05，##P<0.01。下同

A. E1菌株；B. E26菌株；C. E28菌株；D. NMG1菌株；E. NMG2菌株

3 討論

RIF抗菌譜廣，抗菌作用強(qiáng)，本研究中MIC測定結(jié)果也證實(shí)RIF對大腸桿菌有較好抗菌活性[5]。本研究中MIC測定顯示EEO、MEO、HEO都對大腸桿菌具有抑菌作用。當(dāng)MBC/MIC比值在4～16時(shí)，藥物對菌株表現(xiàn)抑菌作用[16]；MBC/MIC比值<4時(shí)，藥物展現(xiàn)強(qiáng)殺菌作用[17]。本研究中RIF對大腸桿菌的該比值進(jìn)一步表明RIF、精油對受試菌株均有殺菌或抑菌作用。但3種精油中EEO的抑菌能力稍弱，這可能與不同來源的EEO對大腸桿菌具有不同程度的抗菌作用有關(guān)[18]。

Buldain等[4]發(fā)現(xiàn)RIF與白千層精油聯(lián)用對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)協(xié)同的抑菌作用，也有研究表明MEO與莫匹羅星聯(lián)用對金黃色葡萄球菌表現(xiàn)相加的抑菌作用[19]。本研究得到相似結(jié)果，EEO、MEO、HEO分別聯(lián)合RIF都對抑制浮游菌表現(xiàn)出較好的相加作用。3種組合中EEO聯(lián)合RIF的效果最好，這可能由于精油的不同成分間也具有不同的增效作用，例如肉桂醛和丁香酚聯(lián)用對單核李斯特菌的抗菌活性大于肉桂醛和β-石竹烯聯(lián)用[20]。

生物被膜中的細(xì)菌對抗菌藥的耐受性通常是浮游菌的10至1 000倍[2]。精油中有牛至油等被證明對葡萄球菌的生物被膜的形成有阻抑作用[21]。本研究中的MBIC/MIC比值證實(shí)了RIF、EEO、MEO及HEO對大腸桿菌生物被膜都有很好的抑制作用，精油的抑膜作用優(yōu)于RIF，且EEO與MEO的抑膜作用最好。這或許與精油除改變膜通透性外也可使細(xì)菌遺傳物質(zhì)功能紊亂達(dá)到抗菌作用有關(guān)[5]。雖然單獨(dú)使用EEO對浮游菌抑菌效果稍弱，但EEO和RIF的聯(lián)合抑菌效果最好，且EEO的抑膜效果優(yōu)越，綜合這幾項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果，本研究選用了RIF和EEO進(jìn)行亞抑菌濃度的被膜影響試驗(yàn)。

利福平在1/2 MIC濃度時(shí)可抑制表皮葡萄球菌的生物膜形成[22]。本研究中1/2 MIC的RIF也對大腸桿菌被膜形成和預(yù)制被膜都有破壞作用。亞抑菌濃度的1,8-桉葉素(EEO主要成分)可以抑制大腸桿菌形成的生物膜的活性[23]。本研究中EEO對被膜形成和預(yù)制被膜都有一定抑制作用，且呈現(xiàn)一定濃度依賴性。Liu等[24]發(fā)現(xiàn)利福平和麥盧卡蜂蜜對產(chǎn)金黃色葡萄球菌的生物膜具有很強(qiáng)的協(xié)同作用，也有研究證實(shí)EEO聯(lián)合氯己定二葡萄糖酸鹽與后者單用相比對表皮葡萄球菌被膜表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用[25]。本研究中1/2 MIC的RIF和亞抑菌濃度的EEO聯(lián)用時(shí)，對大腸桿菌的被膜形成起抑制作用，但僅與高濃度EEO(1/2 MIC～1/4 MIC)聯(lián)用時(shí)，對預(yù)制被膜有一定消除作用。亞抑菌濃度的RIF聯(lián)合EEO抑制被膜表現(xiàn)出相加效果，但RIF和EEO單獨(dú)及聯(lián)用對預(yù)制被膜消除能力都弱于對被膜形成過程的抑制，這可能由于已存在的細(xì)菌聚集體比細(xì)菌聚集過程更難以破壞，如0.1%的柑橘油能抑制金黃色葡萄球菌被膜形成卻無法消除預(yù)制被膜[15]。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與單獨(dú)使用RIF或EEO相比，兩者聯(lián)合對于大腸桿菌的浮游菌、生物被膜都有更強(qiáng)的抑制作用，這為繼續(xù)探究RIF和EEO聯(lián)用應(yīng)用于防治大腸桿菌感染的牛乳房炎提供了一定的研究基礎(chǔ)。