陸艷 王敏 曹西友

青光眼是臨床上常見的眼科疾病之一，臨床表現(xiàn)為眼壓持續(xù)或間斷升高，當超過眼球承受能力后，出現(xiàn)視神經(jīng)萎縮及視野缺損，嚴重時可致失明[1]。青光眼治療的主要目的是降低眼壓，包括藥物、激光及手術3種方法[2]。藥物治療目前仍存在不少并發(fā)癥，且需長期堅持用藥，治療效果依賴于患者的用藥依從性；激光治療對于大多數(shù)青光眼患者只有短期療效，效果不佳；青光眼濾過性手術仍是目前臨床治療青光眼的重要手段，可有效降低患者眼壓，但術后患者濾過區(qū)組織易發(fā)生纖維組織增生、瘢痕化等，導致手術失敗[3]。有學者指出，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在瘢痕化形成中發(fā)揮著重要作用[4]，為此本文就轉(zhuǎn)化生長因子-β在青光眼濾過泡瘢痕化過程中轉(zhuǎn)臨床作用展開相關研究，報告如下。

資料與方法

一、 實驗動物與分組

選取64只成年健康雄性SD大鼠，重量(250～350)g，平均重量(305.72±28.65)g，隨機等分為A、B、C、D、E、F、G、H組，每組8只。所有SD大鼠入組前雙眼均經(jīng)過檢查(裂隙燈及直接檢眼鏡)，所有SD大鼠雙眼均正常。A組為對照組，不做任何處理，B-H組建立右眼球結膜濾過泡模型，術后觀測濾過泡形成情況并監(jiān)測眼壓，剪取B-G組SD大鼠濾過術區(qū)結膜及結膜下組織進行Western印跡法檢測。

二、制備模型

所有入組SD大鼠飼養(yǎng)1周后，實驗眼(均為右眼)行前房引流管植入術，建立大鼠球結膜濾過泡模型，具體步驟如下[5，6]：取10%水合氯醛(陜西圣瑞醫(yī)藥科技有限公司，國藥準字H37022673)，按照0.3 ml/100 g的劑量緩慢注射大鼠腹腔誘導麻醉，在此基礎上給予大鼠右眼0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液(山東博士倫福瑞達制藥有限公司，國藥準字H20056587)表面麻醉，對術眼進行消毒沖洗后鋪上無菌洞巾；取大鼠術眼眼球顳上方角膜緣后2～2.5 mm處，以角膜緣為基底，做長2～3 mm的結膜瓣，剪開球結膜后分離Tenons囊至鞏膜面，取24G胰島素針針頭于距角膜緣約0.5 mm處穿刺入前房，注入黏彈劑以維持前房，取25G長度3～4 mm微管，將穿入前房端剪成斜面，斜面向上，末端為平面，沿著鞏膜隧道穿刺入前房。植管成功后，采用10-0線連續(xù)縫合球結膜及Tenons囊，術后結膜囊內(nèi)涂抹紅霉素眼膏(廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司，國藥準字H44023089)。術后待大鼠完全清醒后，送回飼養(yǎng)房，注意保暖，術后3 d內(nèi)雙眼均滴注0.25%氯霉素滴眼液(長春迪瑞制藥有限公司，國藥準字H22023503)，2次/d。

三、眼壓測定

誘導麻醉及表面麻醉同上，使用Tonolab眼壓計(上海慕聚醫(yī)療器械有限公司)測量A-H組各時間點的SD大鼠術眼(右眼)眼壓，具體方法[7]為保持測量探頭水平且位于距角膜3～5 mm角膜頂點處，使得探頭水平與視軸夾角≤25°，測量6次，取平均值。

四、取材及標本處理

A組大鼠于實驗室飼養(yǎng)1周后處死；B-H組大鼠分別于各時間點測量眼壓，手術完成后1、3、5、7、14、21及28 d處死，剪取濾過區(qū)結膜及結膜下組織，使用細胞裂解液提取總蛋白，行Western印跡法(具體步驟如下文)檢測TGF-β[8]。

五、Western印跡法檢測TGF-β

對A-H組大鼠取得的總蛋白進行凝膠電泳后將蛋白印記轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜[9]，室溫下封閉液封閉1 h，加入一抗稀釋液：兔抗大鼠單克隆抗體TGF-β1(美國Abcam公司，1:400稀釋)或小鼠抗大鼠單克隆抗體TGF-β2(美國Abcam公司，1:5000稀釋)，室溫下孵育2 h，PBS-T漂洗3次，10 min/次。再加入二抗稀釋液：山羊抗兔抗體(中國康為世紀公司，1:5000稀釋)，室溫下孵育1 h，PBS-T漂洗3次，10 min/次。采取增強化學發(fā)光法顯示跡象，在感光底片上曝光后保存結果，將顯影后X線片掃描成圖片后，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)，以測得GAPDH的灰度掃描為基線水平對蛋白條帶進行灰密度值讀數(shù)并記錄[10]。

六、統(tǒng)計學分析方法

結果采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行處理并進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

所有SD大鼠術后一般情況好，精神、活動及飲食正常；術眼眼瞼未見明顯紅腫，結膜囊未見感染，球結膜切口對合好，縫線在位，未見感染；濾過泡完整，未見滲漏，可見不同程度隆起；角膜透明，未見水腫及缺損；前房未見出血，可見不同程度房水閃輝及房水細胞，術后2～4 d內(nèi)消失。

一、結膜濾過泡形成情況

B-H組均在術后1 d成功建立不同程度隆起的球結膜濾過泡，濾過泡生存時間7～23 d，平均(13.26±5.73)d，一般術后4～5 d濾過泡出現(xiàn)表面血管化。

二、SD大鼠術后眼壓變化情況分析

術眼在術后眼壓先下降后回升至正常，術后1～5 d術眼眼壓低于正常組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 A-H組大鼠眼壓變化情況(mmHg)

三、SD大鼠術后TGF-β表達分析

將B組-H組SD大鼠數(shù)據(jù)匯總，與A組相比，Western印跡法顯示TGF-β1及TGF-β2均在術后1 d明顯增高，TGF-β1持續(xù)至術后5 d達峰值，TGF-β2持續(xù)至術后7 d達峰值，隨后均逐漸降低至術后 28 d，但表達量仍高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2，3。

表2 A-H組大鼠術后Western印跡法檢測TGF-β1蛋白相對表達

表3 A-H組大鼠術后Western印跡法檢測TGF-β2蛋白相對表達

討 論

一、青光眼濾過性手術濾過泡瘢痕化形成機制

青光眼濾過性手術作為一種外科手術，對患者眼部的角膜、鞏膜、結膜、虹膜及小梁網(wǎng)等均可能形成損傷，同時可造成微血管破損，導致紅細胞、血小板及血漿蛋白的滲漏，進而刺激局部激素的釋放，如組胺、5-羥色胺等[11]。隨著患者體內(nèi)血小板的活化，一方面參與凝血，另一方面釋放各類生長因子，如血小板衍生生長因子(platecet derived growth factor，PDGF)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等。同時，一些細胞因子如TGF-β也被釋放，患者體內(nèi)中性粒細胞及單核細胞聚集，在TGF-β的誘導下單核細胞轉(zhuǎn)化成巨噬細胞，促進患者體內(nèi)的炎癥反應。PDGF與TGF-β是重要的促纖維化細胞因子，可以有效激活成纖維細胞。在炎癥反應中，巨噬細胞及血小板活化產(chǎn)生的PDGF可刺激成纖維細胞及炎癥細胞產(chǎn)生TGF-β，TGF-β的增多進一步反饋刺激其他成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，促進合成膠原蛋白[12]。在此基礎上，血小板分泌的促血管生長因子(如VEGF、堿性成纖維細胞生長因子) 、巨噬細胞、傷口處低氧及乳酸形成的環(huán)境均參與協(xié)同血管形成。在血管形成的過程中，會出現(xiàn)黏蛋白沉積，Ⅰ型膠原蛋白逐步取代Ⅲ型膠原蛋白，之后膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)及脫水，肉芽組織內(nèi)的成纖維細胞逐漸凋亡，導致細胞成分減少，最后轉(zhuǎn)變?yōu)轳：劢M織[13]。

二、TGF-β在大鼠術后濾過泡瘢痕化過程中的表達

本次研究采用SD大鼠制備模型，并用Western印跡法檢測大鼠濾過區(qū)結膜及結膜下TGF-β1及TGF-β2的動態(tài)表達。通過不同時間點的檢測發(fā)現(xiàn)，TGF-β1及TGF-β2均在術后均呈現(xiàn)升高趨勢，TGF-β1持續(xù)至術后5 d達峰值，TGF-β2持續(xù)至術后7 d達峰值，隨后均逐漸降低至術后28 d，但表達量仍高于正常對照組。在大鼠模型制備過程中，手術操作屬于損傷性手術，會對大鼠眼部血-房水屏障造成破壞，血漿及活化的血小板分泌釋放TGF-β前體，同時手術區(qū)域也會分泌TGF-β，由此可以解釋術后1 d TGF-β明顯升高的現(xiàn)象。當濾過區(qū)局部TGF-β濃度升高至一定程度后，會刺激結膜囊成纖維細胞，促進濾過區(qū)巨噬細胞及單核細胞分泌TGF-β，因此術后TGF-β1及TGF-β2與大鼠濾過泡瘢痕化進程呈現(xiàn)一致性[14]。

三、針對TGF-β信號通路的治療方法

由青光眼濾過性手術濾過泡瘢痕化形成機制及動物實驗可以發(fā)現(xiàn)，TGF-β在濾過泡瘢痕化形成中發(fā)揮重要作用，因此可以針對TGF-β信號通路采取相應的治療方法。TGF-β生物效應復雜多樣，參與調(diào)節(jié)細胞分化、促進血管生成及促進炎癥反應等。TGF-β單體發(fā)揮其生物學作用一般通過信號轉(zhuǎn)導通路，包括Smad通路及非Smad通路(Rho激酶信號通路、AKT信號通路及P38/MAP通路)[15]。在Smad通路中TGF-β與細胞表面跨膜受體TGF-β1受體和TGF-β2受體相結合，活化素受體激酶被活化，促使細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導蛋白Smad 2和Smad 3磷酸化，與Smad 4形成復合物，進一步調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄。Rho激酶信號通路在細胞的信號轉(zhuǎn)導通路中可作為信號轉(zhuǎn)換器或分子開關，作用于細胞骨架或其靶蛋白，進而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄及細胞周期等。因此，臨床上可針對TGF-β信號通路采用相對應的抑制劑，進而抑制濾過區(qū)瘢痕化，臨床上亦有相關報道。

四、結論

TGF-β1及TGF-β2參與球結膜濾過泡瘢痕化過程，兩者表達量的增加與瘢痕化進程一致。